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Wednesday, 18th September 2019

La citometría de flujo es una herramienta de análisis que permite discriminar partículas de diferente tamaño y color. Esta técnica de análisis es utilizada de forma rutinaria en muchos laboratorios clínicos y de investigación para medir y cuantificar propiedades fenotípicas, bioquímicas y/o moleculares de células individualizadas mediante la utilización de sondas fluorescentes específicas de uno o varios parámetros celulares.

La principal característica de la citometría es que puede ofrecer de forma muy rápida información simultánea de varios parámetros de cada una de las partículas analizadas, así como la relación entre dichos parámetros. Los parámetros analizables por citometría de flujo son: i) los relacionados con las características físicas de la partícula: el tamaño y la complejidad y ii) las distintas fluorescencias asociadas a la partícula. El análisis se realiza a velocidades de miles de células/segundo, lo que permite obtener datos de elevada fiabilidad estadística, así como identificar poblaciones representadas en baja frecuencia dentro de la población global. Otra importante característica de la citometría de flujo es que el análisis se realiza en una suspensión de partículas individualizadas, por lo que las partículas o células objeto de análisis deben encontrarse en suspensión y en forma de partícula (célula) única. Finalmente, es importante destacar que existe una restricción respecto al tamaño de las partículas objeto de análisis, ya que estas deben tener tamaños comprendidos entre las 0.5-100um.

Representación de datos

La información obtenida por técnicas de análisis de citometría de flujo se representa en forma distribuciones de frecuencia o histogramas de una o dos dimensiones. En los histogramas de una dimensión o parámetro se representa el número de células o partículas (en el eje de ordenadas) frente a la intensidad de fluorescencia de un parámetro (en el eje de abcisas) (figura A). Las distribuciones de frecuencia de dos parámetros, también denominadas citogramas, representan en cada eje la intensidad de fluorescencia de un parámetro diferente. Las más comunes son las distribuciones de frecuencia de puntos (“dot plots”) donde cada punto representa a una partícula analizada, y la distribución de los puntos permite visualizar las contribuciones relativas de cada región de rangos de intensidad de fluorescencia. También se utilizan distribuciones de frecuencia o de densidad de dos dimensiones en los que la proporción de las células en cada región se definen por una escala de color o por gradientes de curvas de contorno. La utilización de representaciones en dos dimensiones permite establecer de manera visual cual es la correlación entre cualesquiera dos parámetros (figura B). Otra característica propia del análisis de datos de citometría de flujo es la utilización de ventanas de análisis (“gates”) (figura C). El establecimiento de ventanas de análisis se utiliza tanto para seleccionar de manera específica la población de células o partículas de interés, normalmente en base a los parámetros de dispersión frontal y ortogonal de la luz, como para simplificar el análisis de poblaciones heterogéneas en las que se analizan simultáneamente un número elevado de parámetros.

Cell Sorting

Aplicaciones comunes de la citometría de flujo:

  • Inmunofenotipo
  • Análisis del ciclo celular
  • Genes reporteros
  • Medida de la proliferación celular
  • Apoptosis
  • Flujo de calcio
  • Señalización intracelular: detección de fosfoproteínas a nivel unicelular
  • Ensayos Multiplexado de moléculas en disolución

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