Viernes, 20 de Julio de 2018

Virología y microbiología

    Retrotranscriptasa del virus de la inmunodeficiencia humana y terapia antirretroviral

 

 

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Luis Menéndez-Arias

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de Investigación:

A pesar de los éxitos de la terapia antirretroviral, las infecciones causadas por los virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 y 2 (VIH-1 y VIH-2, respectivamente) son responsables de 1,6 millones de muertes cada año. La retrotranscriptasa (RT) del VIH juega un papel clave en la replicación del ARN genómico vírico y sus inhibidores constituyen la base de los tratamientos más utilizados y eficaces.

Desde hace años, nuestros esfuerzos se han dirigido hacia la determinación de mecanismos moleculares implicados en resistencia a inhibidores de la RT y conocer el papel que juegan distintos aminoácidos en su especificidad de nucleótido y fidelidad de copia. A lo largo de nuestras investigaciones hemos obtenido RTs del VIH-1 que presentan elevada estabilidad térmica y/o fidelidad de síntesis de ADN. Algunas de estas RTs son comercializadas en la actualidad y se usan en distintas aplicaciones biotecnológicas tanto en investigación básica como clínica. Objetivos futuros incluyen el desarrollo de nuevas RTs con elevada afinidad por ácidos nucleicos que pudieran ser útiles en amplificación de ARN a partir de células individuales.

Aunque los análogos a nucleósido constituyen la base de las terapias actuales frente al VIH, las mutaciones asociadas con resistencia a estos inhibidores son diferentes en el VIH-1 y en el VIH-2. Uno de nuestros objetivos es determinar qué aminoácidos son los responsables de estas diferencias.

Actualmente, la prevalencia de mutaciones de resistencia está aumentando en los países menos desarrollados, lo que hace pensar que se necesitarán nuevos fármacos antirretrovirales que exploten otras dianas del ciclo replicativo del VIH. En este sentido, también estamos interesados en la actividad ribonucleasa H de la RT, y en identificar factores del hospedador que pudieran comprometer la eficacia replicativa del VIH.

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Superposición de modelos moleculares de complejos ternarios constituidos por la RT silvestre del VIH-1 o los mutantes D67N/K70R y D67N/K70R/K73M, unidos a ADN de doble cadena y un nucleótido entrante. Se muestra la horquilla β3-β4, el dNTP entrante y los dos Mg2+ del centro catalítico, para resaltar la influencia de Met-73 en la interacción de Arg-70 con el dNTP entrante. Para más detalles, véase el trabajo de Álvarez et al. (2017) J. Biol. Chem., en prensa.         Ensayos de RT-PCR en los que se muestra el efecto de la temperatura sobre la síntesis de cDNA catalizada por distintas variantes de la RT del VIH-1 grupo O (Matamoros et al. 2013; Biochemistry 52, 9318).

 


 

Publicaciones relevantes:

  • Menéndez-Arias, L. (2013) Molecular basis of human immunodeficiency virus type 1 drug resistance: Overview and recent developments. Antiviral Res. 98, 93-120; doi: 10.1016/j.antiviral.2013.01.007.
  • Álvarez, M., Barrioluengo, V., Afonso-Lehmann, R., Menéndez-Arias, L. (2013) Altered error specificity of RNase H-deficient HIV-1 reverse transcriptases during DNA-dependent DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 41, 4601-4612.  
  • Betancor, G., Álvarez, M., Marcelli, B., Andrés, C., Martínez, M.A., Menéndez-Arias, L. (2015) Effects of HIV-1 reverse transcriptase connection subdomain mutations on polypurine tract removal and initiation of (+)-strand DNA synthesis. Nucleic Acids Res. 43, 2259-2270.   
  • Álvarez, M., Sebastián-Martín, A., García-Marquina, G., Menéndez-Arias, L. (2017) Fidelity of classwide-resistant HIV-2 reverse transcriptase and differential contribution of K65R to the accuracy of HIV-1 and HIV-2 reverse transcriptases. Scientific Reports 7, 44384; doi: 10.1038/srep44834.  
  • Álvarez, M., Nevot, M., Mendieta, J., Martínez, M.A., Menéndez-Arias, L. (2017) Amino acid residues in HIV-2 reverse transcriptase that restrict the development of nucleoside analogue resistance through the excision pathway. J. Biol. Chem., published on-line, Dec 22nd, 2017; doi:10.1074/jbc.RA117.000177.                

Virología y microbiología

    Bioingeniería de enzimas de levaduras para generar compuestos bioactivos

 

 

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María Fernández Lobato

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de Investigación:

Trabajamos con microorganismos de interés biotecnológico, básicamente hongos y levaduras, productores de compuestos bioactivos. Tratamos de conectar la generación de conocimiento con el desarrollo de aplicaciones biotecnológicas, y básicamente nos centramos en la caracterización de nuevas enzimas productoras de compuestos bioactivos, el análisis de sus determinantes estructurales-funcionales, su mejora operacional utilizando herramientas de biología molecular y en la obtención y caracterización de nuevas moléculas de posible utilidad industrial. Hemos patentado ya en distintos países la aplicabilidad industrial de la mayoría de las proteínas caracterizadas y diseñado métodos para su fijación a soportes sólidos.

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Estructura 3D de la fructofuranosidasa Xd-INV de Xanthophyllomyces dendrorhous, una enzima productora del prebiótico neokestosa. Zoom: detalle del centro activo unido a neoerlosa (fructosil maltosa).

 

Substratos en el sitio activo de la Ffase. A. Las seis unidades de la molécula de inulina (izquierda) y fructosilnistosa (derecha) se representan con esferas. B. Moléculas de inulina (marrón) y fructosilnistosa (verde lima) representadas en stick superimpuestas.

 

Durante los últimos años hemos caracterizando nuevas proteínas de levaduras no convencionales (incluidas en los géneros Xanthophyllomyces, Schwanniomyces, Rhodotorula, etc.) con actividad glicosiltransferasa, aplicables en la producción de azúcares con propiedades prebióticas. En general todas son glicosilhidrolasas (GH) estructuralmente incluidas en las familias GH32, 31, 13 y 2. Hemos resuelto la estructura 3D de la primera proteína de levadura incluida en la familia GH32, asignado una función al dominio beta-sandwich que está presente en todos los miembros de la familia y probado que la oligomerización está implicada directamente en el reconocimiento del sustrato y especificidad. Mejorado enzimas y alterado su actividad biosintética utilizando técnicas de bioingeniería molecular. Más información en:  

Glicoenz200

   INMARE

 


 

Publicaciones relevantes:

  • Ramírez-Escudero, M., M. Gimeno-Pérez, B. González, D. Linde, Z. Merdzo, M. Fernández-Lobato* and J. Sanz-Aparicio* (2016) Structural Analysis of β-Fructofuranosidase from Xanthophyllomyces dendrorhous Reveals Unique Features and the Crucial Role of N-glycosylation in Oligomerization and Activity. J. Biol. Chem (doi/10.1074/jbc.M115.708495). *Both corresponding authors.
  • Gimeno-Pérez,M., D. Linde, L. Fernández-Arrojo, F. J. Plou, and M. Fernández Lobato (2015) Heterologous overproduction of β-fructofuranosidase from Xanthophyllomyces dendrorhous, an enzyme producing prebiotic sugars. Appl Microbiol Biotechnol. 98 (8) 3459-3467 (doi: 10.1007/s00253-014-6145-1).
  • de Abreu, M.A., Alvaro-Benito, M., Plou, F.J., Fernández Lobato, M.* and Alcalde, M.* (2013) Synthesis of 6-kestose using a highly efficient β-fructofuranosidase engineered by directed evolution. Adv. Synth. Catal. 355 (9), 1698-1702. * Both corresponding authors. (doi: 10.1002/adsc.201200769).
  • Linde, D., Estévez, M., Plou, F. J. and Fernández Lobato, M. (2012) Analysis of the neofructooligosaccharides production mediated by the extracellular β-fructofuranosidase Xd-INV from Xanthophyllomyces dendrorhous. Bioresour. Technol. 109, 123-130 (doi: 10.1016/j.biortech.2012.01.023)
  • Alvaro-Benito, M., Sainz-Polo, M.A., González, B., Plou, F.J., Fernández-Lobato*, M. and Sanz-Aparicio*, J. (2012) Structural and kinetic insight reveal that the amino acid pair Gln-228/Asn-254 modulates the transfructosylating specificity of Schwanniomyces occidentalis β-fructofuranosidase, and enzyme that produces prebiotics. J. Biol. Chem. 287, 19674-19686. *Both corresponding authors. (doi:10.1074/jbc.M112.355503)

 

Patentes seleccionadas:

P200402994. New enzyme for the prebiotic production: WO 2006/064078 A1; PCT-ES2005/070177; Europa No 05825223.0. Primer premio a la mejor patente Madrid+d 2008.

P200501875. New fructofuranosydase for prebiotic oligosaccharides obtaining: PCT-ES2006/000435. Europa Nº 06807883.1; USA No. 11/997.233

P200503195. "New fructofuranosydase for the 6-kestose production: PCT-ES2006/000693; Europea No. 06841745-0; USA No. 12/159.164; Japón No. 2008-547993.

P200930001. Biocatalizador inmovilizado basado en alginato para la biotransformación de carbohidratos: PCT-ES2010/070104


 

Tesis doctorales seleccionadas:

  • Patricia Gutiérrez Alonso (2013) Caracterización de dos glicosiltransferasas de oligosacáridos prebióticos de las levaduras Phaffia rhodozyma y Rhodotorula dairenensis. UAM.
  • Miguel Antonio de Abreu Felipe (2011) Studies aimed at improving the funtionality of non-conventional yeast enzymes able to synthesize prebiotic oligosaccarides. UAM. European Program
  • Miguel Álvaro Benito (2011) The study of β-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis reveals new functional elements in the family GH32 of glycosyltransferases and an unconventional genetic code use in this yeast. UAM. European Program
  • María Dolores Linde López (2010) Caracterización Bioquímica, molecular y estructural de una -fructofuranosidasa con capacidad transferasa de la levadura Phaffia rhodozyma aplicable a la producción de oligosacáridos prebióticos. UAM

 

Galería de Imágenes:

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 Virología y microbiología

       Mecanismos moleculares de interacción virus-célula: el modelo del virus

   de la peste porcina africana

 

 

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Yolanda Revilla

Bcompogrupo

Blistado

 

 

 

 

Resumen de Investigación:

El VPPA es un virus DNA de gran tamaño que infecta monocitos y macrófagos de diferentes especies porcinas, causando una enfermedad aguda, frecuentemente fatal, de enorme importancia económica en el mundo. Resulta interesante que el VPPA haya desarrollado una serie de estrategias de escape ante la respuesta inmune,  inflamatoria y apoptótica, muchas de ellas descritas por nuestro grupo años atrás. Recientemente, nuestro laboratorio también ha mostrado que en células infectadas el IF4e/4G se redistribuyen junto a las factorías virales, junto a los ribosomas y la red mitocondrial y son usados para la síntesis de proteínas virales. Finalmente, nuestro último trabajo demuestra que el ASFV entra en las células hospedadoras por un proceso de macropinocitosis, induciendo la polarización de actina hacia los sitios de entrada así como la activación de EGFR, PI3K-Akt, Pak1 y Rac1 por debajo de la membrana. Estas rutas podrían activar los sistemas de defensa innata como la señalización de los receptores Toll hacia la apoptosis o podría activar procesos esenciales para la replicación viral.
A pesar de los notables esfuerzos realizados durante las últimas décadas con el fin de obtener una vacuna preventiva eficiente frente a la infección por el VPPA, aún estamos lejos de conseguirlo. Por tanto, uno de los objetivos de nuestro laboratorio es el desarrollo de una vacuna efectiva contra el VPPA. Para ello, hemos diseñado dos estrategias: 1) la obtención de aislados atenuados mediante el desarrollo eficiente de mutantes por eliminación seriada de los genes virales; 2) la identificación de antígenos relevantes y el desarrollo de vacunas ADN. Ya que los adyuvantes son clave en el desarrollo de diferentes tipos de respuesta inmune, se analizarán aquellos adyuvantes dirigidos frente receptores de la respuesta inmune innata en combinación con las potenciales vacunas con el fin de inducir respuestas inmunitarias protectoras frente al VPPA.

 

 

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La infección de VPPA promueve la traducción cap-dependiente. Activación de eIF4E y eIF4G durante la infección. Inducción de la fosforilación de eIF4E, eIF4G y del represor de 4E-BP.eIF, factor eucarióticode la iniciación de la traducción; 4E-BP, eIF4E proteína de unión a 4E, Mnk-1, kinasa activada por mitógeno1; ASFV, virus de la peste porcina Africana.
  Inducción de "ruffles" durante la entrada del VPPA. El VPPA usa la macropinocitosis para entrar en la célula huésped, induciendo protrusiones en la membrana citoplasmática, las cuales dependen de la reestructuración del esqueleto de actina y de la activación de varias kinasas y Rho GTPasas. Imagen de microscopía electrónica de barrido mostrando los ruffles inducidos por el VPPA (200nm) para entrar en la célula huésped.

 

 


Publicaciones relevantes:

G. Sánchez, E., Quintas, A., Pérez-Núñez, D., Nogal, M.L., Barroso, S., L. Carrascosa, A., and Revilla, Y. (2012). African Swine Fever Virus Uses Macropinocytosis to Enter Host Cells. PLoS Pathogens, 8(6): e1002754.

Jiménez, J.L., Gómez, R., Briz, V., Madrid, R, Bryszews, M., de la Mata, F.J., and Muñoz-Fernández, M.A. (2012) Carbosilanedendrimers as carriers of siRNA. J. Drug Deliv. Sci. Tech., 22: 75-82.

Briz, V., Serramía, M.J., Madrid, R., Turrin, C.O., Caminade, A.M., Majoral, J.P., and Muñoz-Fernández, M.A. (2012) Validation of a Generation 4 Phosphorus-Containing PolycationicDendrimer for Gene Delivery against HIV-1. Curr Med Chem, 19(29):5044-5051.

 

 

 

Virología y microbiología

           Desarrollo de nuevas estrategias para el control y prevención de enfermedades                                        virales:  el virus de la fiebre aftosa como modelo

 

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Francisco Sobrino

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de Investigación:

El virus de la fiebre aftosa (VFA) constituye un interesante modelo, de gran importancia económica, para entender como las interacciones entre un virus con gran capacidad de variación y sus diferentes hospedadores naturales condicionan el control de la enfermedad que produce. Se trabaja en el desarrollo de nuevas vacunas marcadoras frente al VFA que induzcan respuestas humorales y celulares protectoras - empleando como principal modelo un importante hospedador natural del VFA: el cerdo - y en el análisis de su inmunogenicidad.

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Representación de una subunidad pentamérica de la cápsida del VFA mostrando la posición de mutaciones que incrementan (rojo) o reducen (azul) la sensibilidad frente a pH ácido de la partícula viral. VP1 verde, VP2 en magenta, VP3 en cian.  

Modelado molecular del dímero establecido entre la región NH2-terminal de dos moléculas de la proteína 3A del VFA. Se indican los residuos cuya contribución a la dimerización, mediante la estabilización de la interfaz hidrofóbica que media esta interacción, ha sido comprobada experimentalmente.

 

 

Algunas de estas estrategias están siendo empleadas para el desarrollo de nuevas vacunas frente a otra importante enfermedad viral animal, la peste porcina clásica (PPC). Se trabaja, también, en el análisis funcional de distintas proteínas virales en la internalización, el ciclo de multiplicación y la patogénesis molecular del VFA y de otros virus que causan enfermedades vesiculares similares, como el virus de la enfermedad vesicular del cerdo (VEVC) y el virus de la estomatitis vesicular (VSV), tanto en cultivos celulares como en modelos animales. Se presta especial atención a la implicación de proteínas no estructurales en la virulencia y el rango de hospedador virales, mediante el estudio de sus interacciones con diferentes componentes celulares. Se está llevando también un estudio de las implicaciones funcionales de regiones no codificantes del ARN viral, entre otras su capacidad para inducir respuestas inmunes innatas y su uso potencial, fuera del contexto del RNA viral, como elementos antivirales e inmunomoduladores. Además de información básica sobre el ciclo de multiplicación de estos virus, los resultados obtenidos están siendo empleados para la identificación de dianas antivirales y determinantes de atenuación viral, así como para el desarrollo de nuevas estrategias vacunales y antivirales. Como parte de estos estudios se está caracterizando la capacidad del ácido valproico para inhibir la multiplicación de diferentes virus con envoltura.


Publicaciones relevantes:

  • Vázquez-Calvo, A., Saiz, J.C., Sobrino, F*. and Martín-Acebes, M.A. Inhibition of enveloped virus infection of cultured cells by valproic acid. J. Virol. 85, 1267-1274 (2011).
  • Tarradas, J., Monsó, M., Muñoz, M., Rosel, R., Fraile, L., Mora, M., Muñoz, I., Andreu, D., Sobrino, F. and Ganges, L.* Partial protection against classical swine fever virus elicited by dendrimeric vaccine-candidate peptide in domestic pigs. Vaccine 29, 4422-4429 (2011).
  • Martín-Acebes, M., Vázquez-Calvo, A, Rincón, V., Mateu; M.G. and Sobrino, F*. A single amino acid substitution in the capsid of foot-and-mouth disease virus can increase acid resistance. J. Virol. 85, 2733-2740 (2011)
  • Rodríguez-Pulido, M., Borrego, B., Sobrino, F. and Sáiz, M*. RNA structural domains in non-coding regions of foot-and-mouth disease virus genome trigger innate immunity in porcine cells and mice. J. Virol. 85, 6492-6501 (2011).
  • Rodríguez-Pulido, M., Sobrino, F., Borrego, B. and Sáiz. M*. Inoculation of newborn mice with non-coding regions of foot-and-mouth disease virus RNA can induce a rapid, solid and wide-range protection against viral infection. Antiviral Res. 92, 500-504 (2011).
  • González-Magaldi, M., Postigo, R., de la Torre, B.G., Vieira, Y.A., López-Viñas, E., Gómez-Puertas, P., Andreu, D., Kremer, L., Rosas, M. F. and Sobrino, F*. Mutations that hamper dimerization of foot-and-mouth disease virus 3A protein are detrimental for infectivity. J. Virol. 86, 11013-11023 (2012).
  • Vázquez-Calvo,A., Caridi, F., Rodriguez-Pulido, M., Borrego, B., Sáiz, F, Sobrino, F*. and Martín-Acebes, M.A. Modulation of foot-and-mouth disease virus pH threshold for uncoating correlates with differential sensitivity to inhibition of cellular Rab GTPases and decreases infectivity in vivo. J. Gen. Virol. 93:2382-2386 (2012).
  • Vázquez-Calvo, A., Sobrino, F*. and Martín-Acebes. M.A. Plasma membrane phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate is required for internalization of foot-and-mouth disease virus and vesicular stomatitis virus. PLoS ONE, 7(9): e45172. doi:10.1371/journal.pone.0045172 (2012). Rodríguez-Pulido, M., Martín-Acebes, M-A.,
  • Escribano-Romero, E., Blázquez A.B., Sobrino, F., Borrego, B., Sáiz, M., Saiz, J.C.* Protection against West Nile virus infection in mice after inoculation with type I interferon-inducing RNA transcripts. PLoS ONE 7(11): e49494 (2012).
  • Borrego, B., Rodríguez-Pulido, B., Mateos, F., de la Losa, N., Sobrino, F. and Sáiz*, M. Delivery of synthetic RNA can enhance the immunogenicity of vaccines against foot-and-mouth disease virus (FMDV) in mice. Vaccine. 40, 4375-4381 (2013).
  • Sanchez-Aparicio, M.T., Rosas, M.F. and Sobrino, F*. Characterization of a nuclear localization signal in the foot-and-mouth disease virus polymerase. Virology 444, 203-210 (2013).
  • Blanco, E., Cubillos, C., Moreno, N., Bárcena, J., de la Torre, B.G., Andreu and Sobrino, F*. B epitope multiplicity/ and B/T epitope orientation influence immunogenicity of foot-and-mouth disease peptide vaccines. Clin. Dev. Immunol. 2013:475960 (2013).
  • Vazquez-Calvo, A. Caridi, F. Sobrino*, F. and Martín-Acebes, M.A. An increase in acid resistance of foot-and-mouth disease virus capsid is mediated by a tyrosine substitution of the VP2 histidine previously associated with VP0 cleavage. J. Virol. 88, 3039-3042 (2014).
  • Martín-Acebes, M.A., Merino-Ramos, T., Blázquez, A-B., Casas, J., Escribano-Romero, E., Sobrino, F*. and Saiz, J.C*. The Composition of West Nile virus Lipid Envelope Unveils a Role of Sphingolipid Metabolism on Flavivirus Biogenesis J. Virol. 88(20), 12041-54 (2014).
  • González-Magaldi, M., Martín-Acebes, M., Kremer, L. and Sobrino, F*. Membrane topology and cellular dynamics of foot-and-mouth disease virus 3A protein. PLoS ONE. 9(10): e106685. (2014).
  • Caridi, F., Vázquez-Calvo, A., Sobrino, F*. and Martín-Acebes, M.A. The pH stability of foot-and-mouth disease virus particles is modulated by residues Located at the pentameric interface and in the N terminus of VP3. J. Virol. (2015).
  • Borrego, B., Rodríguez-Pulido, M., Revilla, C., Álvarez, B., Sobrino F., Domínguez, J. and Sáiz, M*. Synthetic RNAs mimicking structural domains in the foot-and-mouth disease virus (FMDV) genome elicit a broad innate immune response in porcine cells triggered by RIG-I and TLR activation. Viruses 7, 3954-3973. doi:10.3390/v7072807 (2015).
  • Martin-Acebes, M.A., Gabandé-Rodríguez, E., García-Cabrero, A.M., Sánchez, M.P., Ledesma, M.D., Sobrino, F*. and Saiz, J.C.* Host Sphingomyelin Modulates West Nile Virus Infection in vivo. J. Lipid. Res. 57, 422-32. doi: 10.1194/jlr.M064212 (2016).
  • Blanco E.*, Guerra, G., de la Torre, B.G., Defaus, S., Andreu, D*. and Sobrino, F*. Full protection of swine against foot-and-mouth disease challenge by a bivalent B-cell epitope dendrimer peptide. Antiviral Res. 129, 74-80. doi: 10.1016/j.antiviral.2016.03.005 (2016).
  • The amino acid substitution Q65H in the 2C protein of swine vesicular disease virus confers resistance to Golgi disrupting drugs. Vázquez-Calvo, A., Caridi, F., González-Magaldi, M., Saiz, J.C. Sobrino, F*. and Martín-Acebes, M.A.*. Frontiers Microbiol. 7:612. doi: 10.3389/fmicb.2016.00612 (2016).

* Corresponding author

 


Patentes:

  1. M. Sáiz, F. Sobrino, B. Borrego, M. Rodriguez, J.C. Sáiz y M.A Martín. Uso de una región no codificante del genoma del virus de la fiebre aftosa para la elaboración de un medicamento antiviral.P201130445. España (25 de marzo 2011). PCT solicitada el 25/3/2012 (PCT ES 2012/070198). CSIC-INIA.
  2. C. Cubillo, E. Blanco, J. Bárcena, F. Sobrino y D. Andreu. Peptide vaccines for the prevention of foot-and-mouth disease. P8244EP00. Patente Europea (2 de marzo de 2012). UPF, CSIC, INIA.


Tesis Doctorales:

Mónica González Magaldi (2012). Caracterización de la proteína 3A del virus de la fiebre aftosa. Estudio de su dimerización, capacidad de unión a membranas y dinámica celular. Director: F. sobrino.

Angela Vázquez Calvo (2012). Estudio de los requerimientos para la entrada del virus de la fiebre aftosa en cultivos celulares y caracterización de ácido valproico como compuesto antiviral. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: M.A. Martín Acebes y F. Sobrino.

Yuri A. Vieira (2015).  Contribuciones  al estudio de la funcionalidad de las proteínas no estructurales del virus de la fiebre aftosa. Universidad Autónoma de  Madrid. Directores: M.F. Rosas y F. Sobrino.


 Virología y microbiología

                Morfogénesis bacteriana

 

 

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Miguel Angel de Pedro

Bcompogrupo

Blistado

 

 

 

 

Resumen de Investigación:

Nuestra investigación se centra en el estudio a nivel molecular y fisiológico de la pared celular (sáculo) como elemento morfogenético primario de la célula bacteriana. Además de continuar nuestro trabajo sobre los mecanismos de síntesis y crecimiento de la pared celular en bacterias de ciclo polimórfico, durante los últimos dos años hemos dedicado un importante esfuerzo en dos nuevas direcciones: la caracterización del proceso de producción y liberación de D-amino ácidos por algunas especies bacterianas y el estudio de la diversidad y plasticidad de la pared bacteriana.

fig01-300

Visualización “in vivo” de los sitios de síntesis de la pared celular en: A) Rhizobium meliloti, B) Roseobacter litoralis, C) Erythrobacter aquimaris and D) Asticaccaulis biprosthecium, con un D-amino acido fluorescente.

En el primer caso estamos estudiando la bioquímica y fisiología del proceso, así como su significado en ambientes naturales y comunidades poli-microbianas donde este tipo de mecanismo parece jugar un papel importante de señalización y sincronización de respuestas. Queremos determinar el grado de dispersión del mecanismo ya establecido (liberación de D-amino ácidos) y la posible existencia de mecanismos similares mediados por otros tipos de moléculas efectoras. En el segundo caso, estamos centrando nuestros esfuerzos en una mejor evaluación del grado de diversidad estructural y composicional de las paredes celulares bacterianas, así como de las variaciones de tipo adaptativo que sufren las paredes bacterianas en respuesta a cambios en las condiciones medio ambientales de la bacteria, incluyendo procesos patológicos. Ambos aspectos parecen mucho más diversos de lo generalmente supuesto y su conocimiento preciso permitirá una mejor comprensión de la evolución bacteriana ofreciendo, además, múltiples oportunidades para el control especifico de poblaciones poli-microbianas naturales. En el futuro inmediato seguiremos trabajando en la misma dirección y haremos un esfuerzo especial en el desarrollo de protocolos apropiados para un estudio sistemático y masivo de la variabilidad y modo de crecimiento de las paredes celulares.

 

 

 

 

 


 

Publicaciones relevantes:

  • Cava, F., de Pedro, M.A., Lam, H., Davis, B.M., and Waldor, M.K. (2011) Distinct pathways for modification of the bacterial cell wall by non-canonical D-amino acids. EMBO J. 30, 3442-3453.
  • Cava, F., Lam, H., de Pedro, M.A., and Waldor, M.K. (2011) Emerging knowledge of regulatory roles of D-amino acids in bacteria. Cell. Mol. Life Sci. 68:817-831.
  • Slamti, L., de Pedro, M.A. Guichet, M., and Picardeau, M. (2011) Deciphering morphologycal determinants of the helix shaped Leptospira. J. Bacteriol. 193, 6266-6275.
  • González-Leiza, S.M., de Pedro, M.A., and Ayala, J.A. (2011) AmpH, a bifunctional DD-endopeptidase and DD-carboxypeptidase of Escherichia coli. J. Bacteriol. 193, 6887-6894.
  • Acosta, F., Alvarez, L., de Pedro, M.A., and Berenguer, J. (2012) Localized synthesis of the outer envelope from Thermus thermophilus. Extremophiles 16, 267-275

 Virología y microbiología

   Efectos de elementos extracromosómicos sobre el comportamiento de su huésped

 

 

grupo-400

 


 

 

Wilfried J.J Meijer

Bcompogrupo

Blistado

 

 

 

 

Resumen de Investigación:

fig01-300
Efecto inhibitorio de la proteína Rok_LS20, expresado a partir de pLS20, sobre la competencia de B. subtilis. Las células competentes son de color verde debido a la expresión de la proteína fluorescente verde, cuyo gen está controlado por un promotor específico de la ruta de competencia. Las membranas se han teñido rojo. La cepa contiene una copia del gen rokLS20, del plásmido pLS20, bajo control de un promotor inducible por IPTG. A y B. Células sin y con inducción de la expresión de Rok-LS20.

fig02-300

Mapa genético del plásmido conjugativo pLS20 de B. subtilis.

Los elementos genéticos móviles (MGE) (fagos, plásmidos, transposones e "ICEs"), se pueden transferir horizontalmente entre células bacterianas afectando a la composición genética y por tanto, a su comportamiento. En consecuencia, la transferencia genética horizontal (HGT) tiene un papel crucial en la evolución microbiana, así como importantes implicaciones en una gran variedad de problemas tanto a nivel de salud ambiental como pública. Por ejemplo, la "HGT" es la principal responsable de la aparición y rápida dispersión de la resistencia a los antibióticos.
Se sabe poco, especialmente en bacterias Gram-positivas, acerca de los mecanismos por los cuales los "MGE" ejercen sus efectos sobre el comportamiento de su hospedador ó en la regulación de su movilidad. Una mejor comprensión del tema es crucial para hacer frente a importantes amenazas. Estudiamos estas cuestiones utilizando como bacteria hospedadora Bacillus subtilis y como "MGE" plásmidos y fagos.
Trabajamos con B. subtilis porque (i) probablemente es la bacteria Gram-positiva mejor estudiada, (ii) no es patógena, (iii) es susceptible a la manipulación genética, y (iv) porque está relacionada con bacterias patógenas como B. anthracis, B. cereus y, aunque con mayor distancia filogenética, Listeria monocytogenes.

Nosotros hemos secuenciado y anotado los primeros dos plásmidos de B. subtilis y actualmente les estamos caracterizando con el objetivo de mejorar nuestro conocimiento acerca de la regulación de sus genes de movilidad y los efectos sobre su huésped.

Muchas bacterias Gram positivas tienen una gran importancia industrial o científica, no obstante, estas bacterias generalmente se resisten a una manipulación génica dirigida. Nuestro objetivo es construir vectores versátiles, basados en los sistemas de conjugación que estamos estudiando, que permitan la modificación génica de estas bacterias.

A menudo, la infección por fagos cambia el comportamiento de su huésped, sin embargo desconocemos cómo dichos fagos ejercen estos efectos. Entre nuestros objetivos se encuentra el intentar averiguar el funcionamiento de estos mecanismos, usando como sistemas modelos dos fagos.

 

 

 


 

Publicaciones relevantes:

  • Singh, P. K., Ramachandran, G., Durán-Alcalde, L., Alonso, C. Wu, L.J., and Meijer, W.J.J. (2012) Inhibition of Bacillus subtilis natural competence by a native, conjugative plasmid-encoded comK repressor protein. Environ. Microbiol. 14, 2812-25

 Virología y microbiología

              Modulación de la respuesta inmune por virus

 

 

 grupo-400

 


 

 

Antonio Alcamí

Bcompogrupo

Blistado

 

 

 

 

Resumen de Investigación:

Estamos investigando mecanismos de evasión inmune utilizados por virus DNA de gran tamaño, poxvirus y herpesvirus. En concreto, estamos caracterizando proteínas virales que se secretan de la célula infectada, interaccionan con citoquinas y quimioquinas, y controlan su actividad inmunomoduladora. Trabajamos en dos sistemas virales: (1) Herpesvirus como el virus herpes simplex, un patógeno humano de relevancia clínica; y (2) Poxvirus como el virus vaccinia, la vacuna de la viruela. Estos receptores virales de citoquinas tiene propiedades inesperadas, aumentando la actividad de quimioquinas o uniéndose a la superficie celular para retenerse en los tejidos infectados, y nos dan información sobre la función de las citoquinas La contribución de los receptores virales de citoquinas a la patologénesis y modulación inmune se está estudiando en ratones infectados con el virus ectromelia, un patógeno natural del ratón que causa una enfermedad parecida a la viruela y conocida como mousepox.

fig01-300  
Proteínas de unión a quimioquinas codificadas por virus.  


Los virus ofrecen una oportunidad única para desarrollar sus estrategias de evasión inmune, optimizadas durante millones de años de evolución, como nuevas aproximaciones terapéuticas. En colaboración con compañías biotecnológicas, estamos desarrollando proteínas inmunomoduladoras virales como potenciales medicamentos para tratar alergias y enfermedades autoinmunes humanas.
Estamos secuenciando el genoma completo de virus DNA de gran tamaño para identificar nuevos genes virales implicados en patogénesis y modulación inmune, incluyendo aislados naturales del virus ectromelia y nuevos iridovirus que infectan peces y anfibios. Los virus son las entidades biológicas más abundantes y diversas en la Tierra. Mediante aproximaciones metagenómicas, estamos caracterizando comunidades virales complejas utilizando metodologías de secuenciación de nueva generación (454-Roche, Illumina). Describimos por primera vez la comunidad de virus en un lago de la Antártida y estamos extendiendo estos estudios a otros lagos en la Península Antártica y en el Ártico. Estamos realizando estudios metagenómicos para identificar virus asociados con patologías humanas, como la esclerosis múltiple.

 

 -- fig02-300
 

Micrografía electrónica de una célula infectada con el virus ectromelia mostrando un cuerpo de inclusión que contiene partículas virales maduras.

 

 

 

 

 


 

Publicaciones relevantes:

  • Alcami, A. and Moss, B. (2011) Smallpox Vaccines. In: Khan, A. S. and Smith, G. L. (eds) Scientific Review of Variola Virus Research 1999-2010. World Health Organization, Geneva, Switzerland, pp. 1-15.
  • Alejo, A., Pontejo, S. M., and Alcami, A. (2011) Poxviral TNFRs: properties and role in viral pathogenesis. Adv. Exp. Med. Biol.691, 203-210.
  • Montanuy, I., Alejo, A., and Alcami, A. (2011) Glycosaminoglycans mediate retention of the poxvirus type I interferon binding protein at the cell surface to locally block interferon antiviral responses. FASEB J. 25, 1960-1971.
  • Xu, R., Rubio, D., Roscoe, F., Krouse, T. E., Truckenmiller, M. E., Norbury, C. C., Hudson, P. N., Damon, I. K., Alcami A., and Sigal, L. J. (2012) Antibody inhibition of a viral type I interferon decoy receptor cures a viral disease by restoring interferon signaling in the liver. PLoS Pathogens 8(1):e1002475.
  • Viejo-Borbolla, A., Martinez-Martín, N., Nel, H. J., Rueda, P., Martín, R., Blanco, S., Arenzana-Seisdedos, F., Thelen, M., Fallon, P. G., and Alcami, A. (2012) Enhancement of chemokine function as an immunomodulatory strategy employed by human herpesviruses. PLoS Pathogens 8(2): e1002497.

Patentes:
- Martín-Pontejo, S. y Alcami, A. Unión a glicosaminoglicanos de proteínas con dominio SECRET codificadas por poxvirus. Número de prioridad: P201230540. País: España. Fechas de prioridad: 11 abril 2012. Propietario: CSIC.
- Cabrera, J. R., Viejo-Borbolla, A., Martínez-Martín, N., Wandosell, F. y Alcami, A.. 'Proteína viral recombinante SgG2 y/o complejos binarios SgG2-FNs para su uso en crecimiento y/o regeneración axonal'. Número de p rioridad: P201231654. País: España. Fecha de prioridad: 26 octubre 2012. Propietario: CSIC.


Tesis Doctorales:

Sergio Martín Pontejo (2012). Características moleculares y funcionales de los receptores solubles del TNF con capacidad anti-quimioquinas de poxvirus. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Begoña Ruiz Argüello y Antonio Alcamí.

Marcos Palomo (2012). Caracterización de inhibidores solubles de interferón codificados por poxvirus. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Antonio Alcamí.

Nadia Martínez Martín (2012). Herpes simples virus glycoprotein G enhances chemotaxis and axonal growth through modification of plasma membrane microdomains and receptor trafficking. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Abel Viejo Borbolla y Antonio Alcamí.


Otras actividades:

- Miembro del Editorial Board de Virology.
- Miembro de Editorial Board de Journal of Virology
- Consejero del World Health Organization Advisory Committee on Variola Virus Research
- Organizador, junto con R. Blasco y E. Villar, del XIX International Poxvirus, Asfarvirus and Iridovirus Conference. Salamanca, Junio 2012
- Grupo integrante de la Red Española de Esclerosis Múltiple (www.reem.es)

 

Virología y microbiología

                      Ingeniería de virus y Nanobiotecnología

 

Mauricio GarciaMateuGrupo 


 


Mauricio García Mateu

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de Investigación:

Objetivos científicos principales: Utilizamos técnicas de ingeniería de proteínas y análisis bioquímicos, biofísicos y virológicos para el estudio del ensamblaje, estabilidad y dinámica conformacionales y propiedades físicas de virus, y sus implicaciones biológicas (Mateu (ed.) (2013) Structure and Physics of Viruses, Springer 2013). Además nos basamos en los resultados de estos estudios para el diseño y análisis de partículas víricas genética y/o estructuralmente modificadas con vistas a aplicaciones en biomedicina y bionanotecnología (Mateu (2016). En Protein-based Engineered Nanostructures, Springer 2016, pp.83-120).

Relevancia científica e implicaciones tecnológicas: Conocimiento en profundidad de procesos clave para la infección vírica, incluyendo morfogénesis, reordenamientos estructurales de partículas víricas y desencapsidación; aplicación de este conocimiento al diseño de vacunas, fármacos antivirales, biomateriales y nanopartículas modificadas para usos biomédicos o nanotecnológicos.

Algunos resultados más recientes: i) El uso combinado de microscopía de fuerzas atómicas (AFM) y microscopía electrónica nos ha permitido determinar experimentalmente en detalle, por primera vez, la ruta reversible e intermediarios de ensamblaje y desensamblaje de un virus esférico estructuralmente sencillo (Fig.1). ii) Mediante análisis mutacional y determinación de las propiedades mecánicas de virus usando AFM, hemos descubierto una relación entre cambios genéticos en la rigidez mecánica de una partícula vírica y cambios en su propensión a experimentar cambios conformacionales importantes para el proceso de infección (Fig.2). iii) Hemos caracterizado la arquitectura, dinámica y propiedades mecánicas de una nanorecubrimiento bidimensional formado por el autoensamblaje de la proteína de la cápsida del virus del SIDA sobre una matriz sólida. Estos y otros estudios del grupo tienen implicaciones para una mejor comprensión de procesos esenciales para la infección por virus, el diseño de nuevos antivirales que interfieran con estos procesos y el desarrollo de nanopartículas y biomateriales bidimensionales de propiedades mecánicas mejoradas para aplicaciones como liberación dirigida de fármacos o regeneración de tejidos.

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Intermediarios durante la ruta de ensamblaje-desensamblaje reversible de la cápsida del virus diminuto del ratón. El ensamblaje procede mediante la formación de un núcleo y la adición gradual de bloques de construcción formados por trímeros de la proteína de la cápsida.

 

  

Relación entre un aumento de la rigidez mecánica del virus diminuto del ratón mediado por interacciones cápsida-ácido nucleico, y un aumento en su resistencia a perder infectividad a través de un cambio conformacional inducido por calor. Este virus parece haber desarrollado durante su evolución sitios de interacción entre la pared interna de la cápsida y su genoma, lo que aumenta su rigidez y, en consecuencia, su resistencia a ser térmicamente inactivado en el medio extracelular.


 


Publicaciones seleccionadas (últimos 10 años):

  • Mateo, R., Luna, E., Rincón, V. and Mateu, M.G. (2008). Engineering viable foot-and-mouth disease virus of increased stability as a step in the development of improved vaccines. J.Virol. 82, 12232-12240.
  • Carrasco, C., Castellanos, M., de Pablo, P.J. and Mateu, M.G. (2008). Manipulation of the mechanical properties of a virus by protein engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 4150-4155.
  • Bocanegra, R., Domenech, R., Nevot, M., Rodriguez-Huete, A., López, I., Fuertes, M.A., Cavasotto, C., Martínez, M.A., Neira, J.L. and Mateu, M.G. (2011). Rationally designed interfacial peptides are efficient in vitro inhibitors of HIV-1 capsid assembly with antiviral activity. PLoS ONE. 6, e23877.
  • Castellanos, M., Pérez, R., Carrasco, C., Hernando-Pérez, M., Gómez-Herrero, J., de Pablo, P.J. and Mateu, M.G. (2012). A balance between stiffness and elasticity provides a mechanical foundation for the infectivity of a virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 12028-12033.
  • Mateu, M.G. (ed.) (2013). Structure and Physics of Viruses. Springer, Dordrecht, The Netherlands.
  • Rincón, V., Rodriguez-Huete, A., López-Argüello, S., Ibarra-Molero, B., Sánchez-Ruiz, J.M., Harmsen, M.M. and Mateu, M.G. (2014). Identification of the structural basis of thermal lability of a virus provides a rationale for improved vaccines. Structure 22, 1560-1570.
  • Castellanos, M., Carrillo, P.J.P. and Mateu, M.G. (2015). Quantitatively probing propensity for structural transitions in engineered virus nanoparticles by single molecule mechanical analysis. Nanoscale 7, 5654-5664.
  • Valbuena, A. and Mateu, M.G. (2015). Quantification and modification of the equlibrium dynamics and mechanics of a virus capsid lattice self-assembled as a protein nanocoating. Nanoscale 7, 14953-14964.
  • Medrano, M., Fuertes, M.A., Valbuena, A., Carrillo, P.J.P., Rodríguez-Huete, A. and Mateu, M.G. (2016). Imaging and quantitation of a succession of transient intermediates reveal the self-assembly pathway of a simle icosahedral virus capsid. J. Am. Chem. Soc. 138, 15385-15396.
  • Carrillo, P.J.P., Medrano, M., Valbuena, A., Rodríguez-Huete, A., Castellanos, M., Pérez, R. and Mateu, M.G. (2017). Amino acid side chains buried along intersubunit interfaces in a viral capsid preserve low mechanical stiffness associated with virus infectivity. ACS Nano 11, 2194-2208.
  • Valbuena, A., Rodríguez-Huete, A. and Mateu, M.G. (2018). Mechanical stiffening of human rhinovirus by cavity-fiilling antiviral drugs. Nanoscale 10, 1440-1452.

Ultimas Tesis Doctorales:

Milagros Castellanos Molina (2011). Análisis mutacional de propiedades estructurales y mecánicas del virus diminuto del ratón, y de sus implicaciones biológicas. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Mauricio G. Mateu.

Rebeca Bocanegra Rojo (2011). Ensamblaje in vitro de la cápsida del virus de la inmunodeficiencia humana, y su inhibición por péptidos diseñados racionalmente. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Mauricio G. Mateu.

Verónica Rincón Forero (2012). Relaciones estructura-función en la cápsida del virus de la fiebre aftosa: algunas implicaciones para el desarrollo de vacunas y antivirales. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Mauricio G. Mateu.

Pablo Pérez Carrillo (2015). Papel de Interfases y residuos interfásicos en la elasticidad mecánica y dinámica conformacional de partículas del virus diminuto del ratón. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Mauricio G. Mateu.

María Medrano García (2018). Fundamentos moleculares del ensamblaje y las propiedades mecánicas de partículas víricas con aplicaciones biotecnológicas y nanotecnológicas. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Mauricio G. Mateu. (prevista lectura Abril 2018)


 

Virología y microbiología

                Variabilidad genética de virus RNA

 

 grupo400

 


Esteban Domingo Solans

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de Investigación:

Nuestro grupo fue pionero en el descubrimiento de las cuasiespecies víricas (1978-1990), una estructura poblacional altamente compleja y dinámica, con implicaciones en evolución y patogenia. Nuestros resultados de los últimos 40 años han sido ampliamente confirmados por la aplicación de secuenciación masiva llevada a cabo en muchos laboratorios durante los últimos tres años. El genoma de una población de virus RNA es un promedio ponderado de miríadas de secuencias distintas, estrechamente relacionadas entre sí que cambian constantemente. La secuencia consenso (o promedio) que escribimos por conveniencia, y que llena libros de texto y bases de datos, es una abstracción que ni tan siquiera puede que exista en la población que trata de representar. Las nubes de mutantes dinámicas están preparadas para responder a ambientes cambiantes mediante la selección de ciertas subpoblaciones de genomas preferentemente sobre otras.

La dinámica de cuasiespecies requiere nuevos abordajes para la prevención y el tratamiento de las enfermedades víricas asociadas a virus RNA, para contrarrestar la capacidad adaptativa conferida por los espectros de mutantes.

Estamos trabajando en el desarrollo de nuevas estrategias antivirales que eviten la selección de virus mutantes que escapen al tratamiento. El trabajo se está realizando principalmente con tres virus: el picornavirus virus de la fiebre aftosa (VFA), el arenavirus virus de la coriomeningitis linfocitaria de ratón (VCML) y más recientemente con el hepacivirus virus de la hepatitis C (VHC). Colaboramos con varios grupos para ampliar la perspectiva de nuestro trabajo: con Nuria Verdaguer (IBM, CSIC) en las alteraciones estructurales de la polimerasa vírica de mutantes de VFA resistentes a agentes mutagénicos; con Juan Carlos de la Torre (Scripps Research Institute, La Jolla) sobre mutagénesis letal de VCML; con  Pablo Gastaminza (CNB, CSIC), Josep Quer, Celia Perales (Hospital Vall d’Hebrón) y Aurora Sánchez (IIB, CSIC) en dinámica de HCV e interacciones hospedador-virus en cultivos celulares y en la clínica.

Durante los últimos años, nuestro énfasis ha sido en el VHC dada su   magnitud como problema de salud pública a nivel mundial y la directa implicación de su dinámica de cuasiespecies en enfermedad hepática y respuesta a tratamientos. Las principales contribuciones de nuestro grupo al VHC han sido: (i) la naturaleza multigénica de la resistencia a interferón; (ii) preparar poblaciones de VHC de distinto fitness para estudiar el efecto del fitness en la biología del VHC; (iii) que el fitness vírico es un determinante de multi-resistencia a drogas en ausencia de mutaciones específicas de resistencia; (iv) la ausencia de equilibrio poblacional (distribución estable de mutaciones y estasis fenotípica) incluso tras multiplicación prolongada del virus en un ambiente celular constante y (v) el diseño de tratamientos secuenciales y de combinación usando agentes antivirales mutagénicos y no-mutagénicos, con el objetivo de suprimir la infectividad (Figura 1). Estas investigaciones continúan actualmente.

La mutagénesis letal es un campo de investigación en expansión que ha abierto un nuevo capítulo de la farmacología antiviral. Nuestro trabajo, en colaboración con el lamentablemente ya fallecido John Holland (UCSD), proporcionó la primera evidencia experimental del efecto negativo del aumento de tasa de mutación provocado por mutagénesis química en la supervivencia de virus RNA (1990-1997). En nuestro cribado actual de nuevos agentes mutagénicos aceptados para uso en humanos, hemos demostrado que el agente antiviral de amplio espectro favipiravir (T-705) es mutagénico para VHC y el VFA y puede extinguir estos virus. Hemos colaborado con el grupo del Dr. Juan Carlos Saiz (INIA) para mostrar que favipiravir es mutagénico para el virus del Oeste del Nilo y que puede extinguir al virus. Seguimos incorporando nuevos agentes antivíricos mutagénicos y no mutagénicos de amplio espectro para nuestros diseños de terapias encaminadas a inhibir un amplio rango de virus RNA patógenos. Un problema crucial no resuelto es la integración de inhibidores mutagénicos y no-mutagénicos en diseños para combatir enfermedades asociadas a virus RNA.

Hemos descubierto un nuevo mecanismo de escape del VFA a mutagénesis letal por ribavirina y 5-fluorouracilo, consistente en la selección de mutantes víricos que pueden modular la incorporación de nucleótidos de manera que se evita el sesgo mutacional que a menudo producen los nucleótidos mutagénicos. Este mecanismo no modifica la amplitud del espectro de mutantes y su correspondiente flexibilidad adaptativa. Interesantemente, una mutación comodín (es decir, aquella que se repite cuando el virus se somete a presiones selectivas distintas) en la proteína no-estructural 2C moduló también la incorporación de nucleótidos como respuesta a la mutagénesis por ribavirina, en ausencia de mutaciones en la polimerasa vírica. Estas observaciones ponen de relieve los múltiples recursos adaptativos que tienen los virus RNA para responder a ambientes hostiles y justifican nuestros esfuerzos en busca de diseños antivirales para inhibir fuertemente la multiplicación de los virus.

Hemos continuado una colaboración con Susanna Manrubia (CNB, CSIC) que ha representado un vínculo altamente clarificador entre estudios teóricos y diseños experimentales. En una conexión interesante entre la expansión de los virus en la naturaleza y la evolución clonal de organismos, hemos propuesto para virus una distinción entre recombinación mecanísticamente activa pero inconsecuente y la recombinación evolutivamente relevante. Basado en la evidencia disponible, pensamos que mutación y recombinación ocurren continuamente durante la replicación de virus RNA pero que la mayoría de genomas mutantes y recombinantes no sobreviven (están sometidos a selección negativa). No obstante, hay subconjuntos de mutaciones que, en combinación con eventos puntuales de recombinación biológicamente relevante, contribuyen a la supervivencia de los virus y a su evolución (Figura 2). Estos estudios también están contribuyendo a un entendimiento más profundo de los acontecimientos a nivel molecular que subyacen a procesos de enfermedad vírica.

Nuestro objetivo principal es usar el nuevo entendimiento de dinámica viral que ha sido proporcionado por el marco de la teoría de cuasiespecies para encontrar nuevas maneras de inhibir la multiplicación viral. Es nuestra convicción que los nuevos diseños antivirales podrán aplicarse al control de virus patógenos ya establecidos así como a virus emergentes y re-emergentes (Figura 3).

 

figura 1

Figura 1: Resumen gráfico de nuestro trabajo reciente acerca de implicaciones de cuasiespecies y mutagénesis letal de virus RNA. El panel de la izquierda ilustra las olas mutacionales (identificadas mediante un color) de VHC cuantificadas mediante clonaje molecular-secuenciación Sanger y por secuenciación masiva, durante la multiplicación del virus en un ambiente biológico constante. Las ondas dibujadas se han identificado por los dos métodos, lo que excluye que se deban a un efecto de muestreo. Los paneles de la derecha ilustran la base conceptual de la mutagénesis letal con un ejemplo de extinción del VHC (arriba), un diseño de pases seriados (en medio) y extinción del VHC asociado a tratamiento con ribavirina (abajo). Información detallada está en las referencias indicadas y en la lista bibliográfica.

 

figura 2

Figura 2: Representación esquemática de la evolución clónica de virus. A partir de una infección inicial (Origin, abajo) se generan múltiples sub-linajes. La recombinación tiene lugar en cada rama (dobles flechas perpendiculares a las ramas). La diversificación biológicamente relevante se ilustra mediante ramas rojas y azules. Recombinación en un punto de discontinuidad (doble flecha grande vertical) es relevante biológicamente porque genera genomas mosaico con nuevos fenotipos. La evolución clónica continúa hasta que se alcanza un nuevo punto de discontinuidad. El esquema no implica una escala de espacio o tiempo. Reproducido de Perales et al. 2015, con permiso de la Academia Nacional de Ciencias de los EEUU.

 

figura 3

Figura 3: Un resumen del abordaje y objetivo principal de nuestra investigación.

 


 

Publicaciones relevantes (desde 2012) agrupadas por temas:

 

 

Implicaciones de cuasiespecies:

  • Domingo, E., Sheldon, J. and Perales, C. (2012). Viral quasispecies evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 76, (2)159-216.
  • Andino, R. and Domingo, E. (2015). Viral quasispecies. Virology, 479-480: 46-51.
  • Domingo, E. Perales, C. (2016). Viral quasispecies and lethal mutagenesis. European Review, 24(1):39-48.
  • Domingo, E. Perales, C. (2016). Species Concepts: Viral quasispecies. In: Kliman, R.M. (ed.), Encyclopedia of Evolutionary Biology, vol.4, pp. 228-235. Oxford: Academic Press.
  • Domingo, E. (2016). Virus as Populations. Composition, complexity, dynamics and biological implications. Academic Press, Elsevier, Amsterdam.
  • Domingo, E., Schuster, P. (eds.) (2016). Quasispecies: From Theory to Experimental Systems.
  • Domingo, E., Schuster, P. (2016). What is a quasispecies? Historical origins and current scope.
  • Gregori, J., Perales, C., Rodríguez-Frías, F., Esteban, J.I., Quer, J., Domingo, E. (2016). Viral Quasispecies Complexity Measures. Virology 493: 227-237.
  • Domingo, E., de la Higuera, I., Moreno, E., de Ávila, A.I., Agudo, R., Arias, A., Perales, C. (2017). Quasispecies dynamics taught by natural and experimental evolution of foot-and-mouth disease virus. In: F. Sobrino and E. Domingo (Eds.). Foot-and-Mouth Disease Virus: Current Research and Emerging Trends, Horizon Scientific Press – Caister Academic Press, Poole, UK, pp. 147-170.
  • Moreno, E.; Gallego, I.; Gregori, J.; Lucia-Sanz, A.; Soria, M. E.; Castro, V.; Beach, N. M.; Manrubia, S.; Quer, J.; Esteban, J. I.; Rice, C. M.; Gomez, J.; Gastaminza, P.; Domingo, E.; Perales, C. (2017). Internal Disequilibria and Phenotypic Diversification during Replication of Hepatitis C Virus in a Noncoevolving Cellular Environment.

 Virus de la fiebre aftosa y polimerasa vírica:

  • Ferrer-Orta, C., de la Higuera, I., Caridi, F., Sanchez-Aparicio, M.T., Moreno, E. Perales, C., Singh, K., Sarafianos, S.G., Sobrino, F. Domingo, E., Verdaguer, N. (2015). Multifunctionality of a picornavirus polymerase domain: nuclear localization signal and nucleotide recognition.
  • Sobrino, F. and Domingo, E. (eds.) (2017). “Foot-and-Mouth Disease Virus: Current Research and Emerging Trends”, Horizon Scientific Press – Caister Academic Press, Poole, UK.

Interacciones VHC-hospedador:

  • Madejón, A., Sheldon, J., Francisco-Recuero, I., Perales, C., Dominguez-Beato, M., Lasa, M., Sanchez-Perez, I., Muntané, J., Domingo, E., Garcia-Samaniego, J., Sanchez-Pacheco, A. (2015). Hepatitis C virus-mediated Aurora B kinase inhibition modulates inflammatory pathway and viral infectivity. Journal of Hepatology, 63(2): 312-9.
  • Perez-del-Pulgar, S., Gregori, J., Rodriguez-Frias, F., Gonzalez, P., García-Cehic, D., Ramirez, S., Casillas, R., Domingo, E., Esteban, J. I., Forns, X., Quer, J. (2015). Quasispecies dynamics in hepatitis C liver transplant recipients receiving grafts from hepatitis C virus infected donors.
  • Valero, M.L., Sabariegos, R., Cimas, F., Perales, C., Domingo, E., Sánchez-Prieto, R., Mas, A. (2016). HCV RNA-dependent RNA polymerase interacts with Akt/PKB inducing its subcellular re-localization.

Resistencia a drogas:

  • Perales, C., Beach, N. M., Gallego, I., Soria, M. E., Quer, J., Esteban, J. I., Rice, C., Domingo, E., and Sheldon, J. (2013). Response of hepatitis C virus to long-term passage in the presence of interferon-α. Multiple mutations and a common phenotype. J. Virol., 87(13), 7593-7607.
  • Sheldon, J., Beach, NM., Moreno, E., Gallego, I., Piñeiro, D., Martínez-Salas, E., Gregori, J., Quer, J., Esteban, JI., Rice, CM., Domingo, E., Perales, C. (2014). Increased replicative fitness can lead to decreased drug sensitivity of hepatitis C virus.
  • Perales, C., Quer, J., Gregori, J., Esteban, J.I., Domingo, E. (2015). Resistance of hepatitis C virus to inhibitors: complexity and clinical implications. Viruses, 7:5746-5766.
  • Gallego, I., Sheldon, J., Moreno, E., Gregori, J., Quer, J., Esteban. J.I., Rice, C.M., Domingo, E., Perales, C. (2016). Barrier-Independent, Fitness-Associated Diferences in Sofosbuvir Efficacy against Hepatitis C virus.
  • Martín, V., Perales, C., Fernández-Algar, M., Dos Santos, HG., Garrido, P., Pernas, M., Parro, V., Moreno, M., García-Pérez, J., Alcamí, J., Torán, JL., Abia, D., Domingo, E., Briones, C. (2016). An Efficient Microarray-Based Genotyping Platform for the Identification of Drug-Resistance Mutations in Majority and Minority Subpopulations of HIV-1 Quasispecies. PLoS ONE, 11(12):e0166902.

Mutagénesis letal:

  • Ortega-Prieto, A.M., Sheldon, J., Grande-Pérez, A., Tejero, H., Gregori, J., Quer, J., Esteban, J.I., Domingo, E. and Perales, C. (2013). Extinction of hepatitis c virus by ribavirin in hepatoma cells involves lethal mutagenesis. PLoS ONE, 8(8): e71039.
  • Perales, C., Domingo, E. (2016). Antiviral strategies based on lethal mutagenesis and error threshold. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 392:323-339.
  • Agudo, R., de la Higuera, I., Arias, A., Grande-Perez, A., Domingo, E. (2016). Involvement of a joker mutation in a polymerase-independent lethal mutagenesis escape mechanism. Virology 494:257-266.
  • De Ávila, A.I., Gallego, I., Soria, M.E., Gregori, J., Quer, J., Esteban, J.I., Rice, C.M., Domingo, E., Perales, C. (2016). Lethal mutagenesis of hepatitis C virus induced by favipiravir. PLoS ONE, 11 (10): e0164691.
  • de Ávila, A. I.; Moreno, E.; Perales, C.; Domingo, E. (2017). Favipiravir can evoke lethal mutagenesis and extinction of foot-and-mouth disease virus. Virus Res., 233, 105-112.
  • de la Higuera, I.; Ferrer-Orta, C.; de Avila, A. I.; Perales, C.; Sierra, M.; Singh, K.; Sarafianos, S. G.; Dehouck, Y.; Bastolla, U.; Verdaguer, N.; Domingo, E. (2017). Molecular and Functional Bases of Selection against a Mutation Bias in an RNA Virus. Genome Biol. Evol., 9 (5), 1212-1228.
  • Escribano-Romero, E., Jiménez de Oya, N., Domingo, E., Saiz, J.C. (2017). Extinction of West Nile virus by favipiravir through lethal mutagenesis.

Evolución general de virus:

  • Perales, C. Moreno, E. Domingo, E. (2015). Clonality and intracellular polyploidy in virus evolution and pathogenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 112(29):8887-92.

 


 

Patentes:

  • N. Sevilla, E. Domingo, C. Escarmís, S. Ojosnegros, J. García-Arriaza, M. Sanz-Rojo, T. Rodríguez. "Vacuna atenuada para la fiebre aftosa". Nº DE SOLICITUD: P200801583. Patente concedida en España el 16/06/2011. Nº PUB: ES2344875.

 


 

Tesis doctorales:

  • Héctor Moreno Borrego (2012).  Dinámica poblacional del virus de la coriomeningitis linfocitaria del ratón en su interacción con agentes mutagénicos. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Verónica Martín.
  • Ignacio de la Higuera Hernández (2014). Factores determinantes del reconocimiento de nucleótidos en el virus de la fiebre aftosa. Universidad Autónoma de Madrid. Director: Esteban Domingo.
  • Ana Mª Ortega Prieto (2014). Mutagénesis letal del virus de la Hepatitis C. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Celia Perales.
  • Elena Moreno del Olmo (2017). Evolución a largo plazo de virus RNA en ambiente biológico constante. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: Esteban Domingo y Celia Perales.

 


 

Otras actividades:

  • Académico Numerario de la Real Academia de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales, adscrito a la Sección de Ciencias Naturales, (2011).
  • Miembro de la Red Española de Biofísica, coordinada por el Dr. David Reguera, desde 2011.
  • Miembro del Global Virology Network, coordinado por el Dr. Robert Gallo, desde 2011.
  • Miembro del Comité Organizador del Congreso FEMS 2011 (Ginebra, Suiza, 2011).
  • Editor asociado de la revista Virus Research desde 2012.

Virología y microbiología

                   Biotecnología y genética de bacterias termófilas extremas

 

 

grupo-400

 


José Berenguer Carlos

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de Investigación:

En nuestro laboratorio estudiamos (1) el metabolismo anaerobio de bacterias termófilas extremas, (2) su transferencia horizontal, y (3) desarrollamos aplicaciones biotecnológicas derivadas de su utilización o de la de sus enzimas. Como modelo principal utilizamos la bacteria termófila extrema Thermus thermophilus (Tth) por ser excepcionalmente manipulable en comparación otros termófilos extremos. Su filogenia ancestral y la estabilidad de sus componentes hacen de Tth uno de los modelos favoritos tanto en Biología Evolutiva como en Biología Estructural.

En los últimos dos años hemos centrado nuestros esfuerzos en el análisis de las enzimas implicadas en los pasos finales de la desnitrificación y en su transferencia horizontal (LGT). Hemos caracterizado la nitrito y la óxido nítrico reductasas codificadas en un agrupamiento génico susceptible de LGT, pero de expresión dependiente del agrupamiento para la respiración de nitrato. Hemos empezado también a estudiar los mecanismos de LGT de ambos agrupamientos, identificando como vía principal el contacto directo célula-célula que, sin embargo, no implica homólogos de proteínas propias de sistemas de conjugación clásicos. También hemos iniciado estudios sobre las barreras que protegen a estas bacterias frente a la entrada de DNA exógeno empleando interferencia mediada por guías de ácidos nucleicos.

   fig01-300  
  Variantes termoestables de proteínas fluorescentes de distintos colores expresadas a 70 ºC en Thermus thermophilus. Se muestra la superposición de fluorescencia y contraste de fases.  

En la línea más aplicada, nuestros esfuerzos se han concentrado principalmente en dos aspectos. Por un lado, hemos procedido a la selección de variantes termoestables de proteínas mediante la utilización de técnicas de interferencia de plegamiento (ej. Esterasa I de P. fluorescens), o diseño racional (ej. proteínas fluorescentes). Por otro, hemos caracterizado y utilizado varias enzimas termoestables de interés biotecnológico, tales como una penicilina acilasa o tres nucleósido fosforilasas.
En los próximos años profundizaremos en los mecanismos de LGT y las barreras frente a éstos, e iniciaremos un proyecto para la identificación y selección in vitro de enzimas termoestables mediante nuevos sistemas de generación de señal.


 

Publicaciones relevantes:

  • Alvarez L., Bricio C., Gómez, M. J., and Berenguer, J. (2011) Lateral transfer of the denitrification pathway among Thermus thermophilus strains. Appl Env. Microbiol 77, 1352-1358.
  • Alvarez, L., Bricio, C., Chahlafi, Z., Cava,F., Hidalgo, A., and Berenguer, J. (2011) Regulación y transferencia horizontal de la desnitrificación en Thermus sp In I.S.B.N. 978-84-8454-806-5. Universidad de Córdoba, Córdoba, Spain, pp. 173-186
  • Bolivar, J. M., Hidalgo, A., Sánchez-Ruiloba, L., Berenguer, J., Guisán, J. M., and López-Gallego, F. (2011).J. Biotech 155, 412-420
  • Bricio, C., Alvarez, L., Gómez, M. J., and Berenguer J. (2011) Partial and complete denitrification in Thermus thermophilus: lessons from genome drafts. Biochem Soc Trans 39:249-253.
  • César, C. E., Alvarez, L., Bricio, C., van Heerden, E., Littauer D. and Berenguer J. (2011) Unconventional lateral gene transfer in extreme thermophilic bacteria. Int Microbiol 14,187-199.

 


 

Tesis doctorales:

Carlos Bricio Garberí (2012) Reducción de óxidos de nitrógeno gaseosos en Thermus thermophilus. Universidad Autónoma de Madrid (mención europea). Director: José Berenguer    

Laura Alvarez Muñoz (2012) Análisis de la respiración de nitrito en Thermus thermophilus. Universidad Autónoma de Madrid(mención europea). Director: José Berenguer

Zahra Chahlafi (2012) Caracterización de la regulación por nitrato en la respiración anaeróbica de Thermus thermophilus. Universidad Autónoma de Madrid. Director: José Berenguer      

Marcos Almendros Giménez (2011) Nuevas enzimas termoestables aplicadas a la síntesis de nucleósidos farmacológicamente activos. Universidad Autónoma de Madrid. Directores: José Berenguer y Josep Vicent Sinisterra    

Federico Acosta Castro (2011) Incorporación de subunidades y crecimiento de la capa S de Thermus thermophilus. Universidad Autónoma de Madrid. Director: José Berenguer  

Eloy Roberto Ferreras Puente (2011) Expresión y estudio de enzimas termoestables de interés biotecnológico. Universidad Autónoma de Madrid. Director: José Berenguer        

 


 

Patentes:


-Torres, L. L., Hidalgo, A., Ferreras, E. R., Berenguer, J. "Polipéptido termoestable con actividad penicilina acilasa, variantes del mismo y sus aplicaciones". Número de prioridad: P201230729. País de prioridad: España. Fecha de prioridad: 14-05-2012     

-Hidalgo, A., Rivera, N, Sánchez, E., Berenguer J. “Polipéptido termoestable con actividad esterasa, variantes del mismo y sus aplicaciones” Número de solicitud: P201231439.  país de prioridad: España. Fecha de prioridad: 17-09-2012


Virología y microbiología

         Ecología molecular de ambientes extremos

 

 

grupo-400

 


Ricardo Amils

Bcompogrupo

Blistado

 

Resumen de Investigación:

Ecología Molecular de Ambientes Extremos: Esta área de investigación persigue los siguientes objetivos:
Acidófilos: ecología microbiana convencional, ecología molecular, biología molecular y biotecnología (biolixiviación, secuestro específico de metales y fitorremediación) de ambientes ácidos extremos (la cuenca del Río Tinto, actividades mineras de la Faja Pirítica Ibérica, río Agrio (Argentina) y la Antártida).

fig01-300  -------  fig02-300
Obtención de muestras del subsuelo en condiciones anaerobias.   CARD-FISH en una muestra de -284m de profundidad.


- Caracterización geomicrobiológica de ambientes extremos como modelos de habitabilidad: la cuenca del Tinto (análogo de Marte), depósitos de sulfuros metálicos de la Antártida (análogo de Marte), la laguna hipersalina de Tirez (análogo de Europa) en colaboración con la profesora I. Marín (UAM), el salar de Uyuni (análogo de Europa) en colaboración con la profesora I. Marín, y zonas de permafrost de Alaska (análogos de Marte).
- Geomicrobiología del subsuelo de la Faja Pirítica Ibérica (IPB): caracterización del bio-reactor subterráneo en la IPB responsable de las condiciones extremas del Río Tinto. Este trabajo se está desarrollando en colaboración con el Centro de Astrobiología (Proyecto ERC IPBSL).
- La línea de ecología microbiana de ambientes anaerobios, dirigida por el profesor J.L. Sanz (UAM), se está desarrollando en los laboratorios que el Departamento de Biología Molecular tienen en el edificio de Biología. Este trabajo está centrado en la caracterización de las actividades anaerobias en los distintos modelos de estudio del grupo de investigación (cuenca del Tinto, subsuelo de la IPB).
Micología. Esta área de investigación está dirigida por el Dr. Aldo González y tiene los siguientes objetivos:
- Genética molecular y microbiología de Basidiomicetos (Pleurotus ostreatus como sistema modelo de estudio).
- Uso de hongos filamentosos como fuente de metabolitos secundarios, enzimas lignolíticas y para secuestro específico de metales.
- Control y eliminación de hongos de aire de interior.
- Transcriptómica y proteómica para el estudio del secretoma.


 

Publicaciones relevantes:

  • Sánchez-Román, M., Romanek, C.S., Fernández-Remolar, D., Sánchez-Navas, A., McKenzie, J.A., Amils, R., and Vasconcelos, C. (2011) Chemical Geology, 281 :143-150. doi:10.1016/j.chemgeo.2010.11.020.
  • Fernández-Remolar, D., Prieto-Ballesteros, O., Gómez-Ortiz, D., Fernández-Sampedro, M., Sarrazin, P., Gailhanou, M., and Amils, R. (2011) Icarus, 211: 114-138.
  • González-Toril, E., Aguilera, A., Souza-Egipsy, V., López Pamo, E., Sánchez-Espada, J., and Amils, R. (2011) Appl. Environ. Microbiol., 77: 2685-2694.
  • Souza-Egipsy, V., Altamirano, M., Amils, R., and Aguilera, A. (2011) Environ. Microbiol., 13(8): 2351-2358, doi:10.1111/j.1462-2920.2011.02506.x.
  • García-Muñoz, J., Amils, R., Fernández, V.M., De Lacey, A., and Malki, M. (2011) Internat. Microbiol., 14: 73-81.

Tesis Doctorales:

Irene Sánchez-Andrea (2012). Diversidad microbiana de los sedimentos anaerobios del Río Tinto. Universidad Autónoma de Madrid, José Luis Sanz y Ricardo Amils.


 Otras actividades:

Editor de Encyclopedia of Astrobiology, Springer, 2011.


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