Jueves, 14 de Diciembre de 2017
    SERVICIO DE TRANSGÉNESIS DE DROSOPHILA
 

Coordinador Científico:
Mar Ruiz Gómez
Responsables Técnicos:
Mar Casado
Eva Caminero

 

Drosophila Transgenesis Service

 

Drosophila Transgenesis Service

 
 


Ofrecemos los siguientes SERVICIOS:


1- Transgénesis clásica mediada por el elemento transponible P:
Con esta metodología se produce la inserción del transgen en posiciones aleatorias del genoma. El plásmido debe contener las repeticiones invertidas del elemento P así como el gen mini-white para identificar los positivos.
Para cada construcción, se requieren 10 microgramos de DNA de alta calidad preparado con el kit Qiagen o similar, en un volumen máximo de 100 microlitros de tampón TE o agua. No es necesario que el usuario aporte el DNA helper.


2- Transgénesis mediada por la integrasa PhiC31 a partir de plásmidos y BACs:

Con esta metodología se produce la inserción de los transgenes en sitios receptores bien definidos del genoma que contienen secuencias attP. Puede encontrar información por ejemplo en este artículo y también en FlyC31.
Los transgenes deben clonarse en vectores que contengan sitios attB y el gen mini-white o vermilion para identificar los positivos. Las preparaciones de DNA deben ser de alta calidad y a una concentración mínima de 300 nanogramos/microlitro en un volumen mínimo de 10 microlitros de agua por cada muestra.
En el servicio utilizamos los siguientes sitios aceptores. En caso de tener otros requerimientos, por favor Esta dirección de correo electrónico está siendo protegida contra los robots de spam. Necesita tener JavaScript habilitado para poder verlo.con nosotras:

Fondo w:
-M{3xP3-RFP.attP'}ZH-22A: Inserción en 2L-22A
-M{3xP3-RFP.attP}ZH-51D: Inserción en 2R-51D
-M{3xP3-RFP.attP'}ZH-68E: Inserción en 3L-68E
-M{3xP3-RFP.attP}ZH-86Fb: Inserción en 3R-86F

Fondo v (necesario para generar líneas estables destinadas a algunas aplicaciones de la tecnología CRISPR/Cas9):
-P{CaryP}attP40: Inserción en 2L-25C7
-P{CaryP}attP2: Inserción en 3L-68A4


3-Inyección de mezclas de ácidos nucleicos para la edición del genoma asistida por la tecnología CRISPR/Cas9:
Podemos inyectar mezclas de ácidos nucleicos que contienen gRNAs, plásmidos que codifican gRNAs y moldes ssDNA o plasmídicos para la edición genómica asistida por la tecnología CRISPR/Cas9. La cepa que utilizamos expresa Cas9 en la línea germinal gracias al promotor de nanos (ver la tabla). El servicio no puede ofrecer soporte técnico sobre el diseño experimental o las distintas aproximaciones técnicas posibles. El usuario debe proporcionarnos la mezcla de ácidos nucleicos ya lista para su inyección. El número de embriones a inyectar también debe definirlo el usuario. Según nuestra experiencia, se necesitan unos 500 embriones para un experimento de knock-in.


PREPARACIÓN DEL DNA
Recomendamos la purificación del DNA mediante el kit Qiagen o similar. La concentración y pureza del DNA deberá ser analizada previa a su envío.


PROCESAMIENTO DE LAS SOLICITUDES
Para la generación de transgénicos mediada por el elemento P o por la integrasa PhiC31, inyectamos entre 150 a 200 embriones por cada plásmido. Las larvas que sobreviven (entre 50 y 100) se envían al usuario 3-4 días después de la inyección. El usuario debe identificar las líneas transgénicas en su laboratorio. En caso de no obtenerse ningún transformante se volverá a repetir la inyección una vez, con prioridad en la lista de trabajo y sin coste adicional.


INSTRUCCIONES
Las muestras se deben enviar a la siguiente dirección:

Mar Casado
Centro de Biología Molecular S.O.
C/Nicolás Cabrera 1
28049-Madrid
Teléfono: +34-911964401


Por favor, incluya también sus instrucciones en el siguiente formulario. Si es la primera vez que utiliza nuestro servicio, debe también firmar el siguiente acuerdo legal.


TARIFAS
Por cada construcción de DNA inyectada:

-Usuarios del CBM/UAM: 40€
-Usuarios del CSIC: 46€
-Usuarios OPIS/U.Pública: 60€
-Otros usuarios nacionales: 63€
-Usuarios internacionales: 120€


CEPAS

 

SISTEMACEPABDSC#

Elemento P
DNA total: 10µg

yw

 

w[1118]

 
PhiC31
>300µg/µl
10µl

2L y[1] M{vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP'}ZH-22A

B#24481

2R y[1] M{vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP}ZH-51D

B#24483

3L y[1] M{vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP'}ZH-68E

B#24485

3R y[1] M{vas-int.Dm}ZH-2A w[*]; M{3xP3-RFP.attP}ZH-86Fb

B#24749

25C y[1] v[1] P{y[+t7.7]=nos-phiC31\int.NLS}X;P{y[+t7.7]=CaryP}attP40

B#25709

68A y[1] sc[1] v[1] P{y[+t7.7]=nos-phiC31\int.NLS}X; P{y[+t7.7]=CaryP}attP2

B#25710

CRISPR/Cas9

Noscas9 y[1] M{w[+mC]=nos-Cas9.P}ZH-2A w[*]

B#54591