Viernes, 15 de Diciembre de 2017

Desarrollo y Regeneración

         Grupo de polaridad epitelial

 

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Fernando M. Belmonte

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Resumen de Investigación:

El interés principal de nuestro grupo es estudiar los procesos de morfogénesis y polaridad epitelial, así como su implicación en algunas patologías humanas como el cáncer. El modelo in vitro en el que se basan nuestras investigaciones es el cultivo organotípico en tres dimensiones de células epiteliales de riñón canino Madin-Darby (3D MDCK). Como modelos in vivo, empleamos conductos del pronefros y intestino de pez cebra (Danio rerio). Asimismo, hemos iniciado una nueva vía de investigación centrada en el uso de células madre embrionarias (ES) para abordar dichas cuestiones.

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Diferentes etapas en la formación de cistos de células MDCKII. Tras cultivar las células MDCKII en matrigel vemos en primer lugar la que los marcadores apicales (en verde) que han quedado de cara a la matrix extracelular son internalizados en endosomas. Parte de los marcadores son reciclados y parte sintetizados, juntos viajan en endosomas la unión entre dos células, sitio en el cual se va a formar la membrana apical. Ocurre una reorganización de las uniones célula-célula y una fusión controlada de vesículas con los mencionados marcadores apicales que da lugar a una nueva membrana apical y consecuentemente a la adquisición de polaridad celular. Una vez definida esta membrana, gracias a la acción conjunta de canales y bombas de iones, aparece el lúmen epitelial. Esta estructura esférica o cisto crece y mantiene su integridad gracias a una regulación fina de la orientación del eje mitótico. La alteración de cualquiera de los procesos mencionados lleva a una desorganización de la estructura epitelial y por tanto su funcionalidad, llevando a la aparición de enfermedades tales como la enfermedad policística y cáncer.

En nuestro laboratorio, estamos muy interesados ​​en el proceso de desarrollo de la polaridad celular en el epitelio. Basándonos en datos extraídos de modelos simples, tales como células en cultivo de mamíferos, estamos empezando a comprender los mecanismos que controlan el establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular en el epitelio y de la integridad de dicho tejido. El sistema de célula epitelial 3D-MDCK es uno de los mejores modelos in vitro para la investigación de la polaridad celular durante la morfogénesis epitelial (Rodríguez-Fraticelli et al., 2011). Sin embargo, este modelo no puede reconstituir la complejidad de la arquitectura que se da in vivo, que incluye diferentes tipos celulares, la remodelación dinámica y la homeostasis tisular. Es por esto que el empleo de sistemas in vivo podría servir para validar y caracterizar mejor los fenotipos observados in vitro. El pez cebra ha mostrado ser un excelente modelo para la caracterización (in vivo) de los mecanismos de formación del lumen identificados en el sistema 3D-MDCK. Por otro lado, recientemente se ha demostrado que las proteínas de polaridad gobiernan la orientación del huso mitótico en las células madre y en el desarrollo epitelial. Además, la conexión entre la pérdida de la polaridad celular, los defectos en los procesos de división asimétrica y la iniciación de tumores es uno de los descubrimientos más sorprendentes e importantes en el campo de la biología del cáncer de los últimos 10 años.

Por tanto, nuestras investigaciones se centran actualmente en el estudio de las proteínas que regulan la formación del lumen durante el desarrollo epitelial y, particularmente, en dos aspectos esenciales de este proceso: el tráfico de membranas y la orientación del huso mitótico. En este sentido, actualmente, contamos con dos grandes proyectos en marcha que son:

1.-Caracterización funcional de la morfogénesis del lumen epitelial utilizando modelos in vitro en 3D y pez cebra.


Se realizó un cribado en dos pasos en el modelo 3D-MDCK para identificar posibles proteínas implicadas en la formación del lumen. Hemos encontrado un conjunto de 14 genes cuya función no ha sido asociada, hasta el momento, al proceso de lumenogénesis, pero se desconoce si tienen alguna implicación en este proceso. Entre ellos se incluyen uniones estrechas y uniones adherentes, Rho GTPasas, genes implicados en la señalización por lípidos y proteínas del tráfico de membranas. Actualmente, ya hemos publicado la función de Slp2a/Slp4 durante la morfogénesis en el modelo 3D (Gálvez-Santisteban et al., 2012).

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Zebrafish tube formation. A). Pez zebra transgénico que expresa un marcador epitelial unido a GFP. Con el uso de BACs estamos desarrollando diferentes líneas transgénicas de pez zebra como la de la foto, que marca específicamente dos túbulos epiteliales de interés, el intestino y el pronephros (riñón primordial), como puede observarse en la magnificación (B). C) Micrografía por microscopía confocal de un corte transversal de un pez zebra de tres días de edad. Pueden identificarse claramente los túbulos epiteliales que conforman el pronephros y el intestino

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El siguiente paso es caracterizar el papel de las proteínas obtenidas en el cribado durante el desarrollo epitelial del pez cebra. Hay tres tubos epiteliales en el pez cebra adecuados para este análisis: el intestino, el tubo neural y los conductos del pronefros. Una de las características más interesantes de la formación del tubo intestinal en el pez cebra es que las células se polarizan y el lumen se forma sin que tengan lugar procesos apoptóticos. Este hecho muestra una similitud crucial con el sistema 3D-MDCK, el cual, en presencia de laminina, forma lúmenes por vaciamiento y sin apoptosis (Martin-Belmonte et al., 2008). Así, la formación del tubo intestinal en pez cebra se presenta como un excelente modelo para la caracterización in vivo del mecanismo molecular y las vías de señalización implicados en la formación del lumen que sean identificados a través del sistema 3D-MDCK. Sin embargo, como el cribado se está realizando en células MDCK, que derivan del riñón, algunas de las proteínas pueden ser específicas de este tejido y, por ello, caracterizaremos su papel en los conductos del pronefros como modelo alternativo. Además de esto, un objetivo secundario es, también, validar nuestro cribado transcripcional en condiciones fisiológicas. Los cambios transcripcionales durante el desarrollo están controlados muy finamente y orquestan un gran número de propiedades que van desde la orientación de los ejes corporales hasta el tamaño y la forma de los órganos.

Hemos visto una serie de genes que se ven inducidos durante la formación del lumen, y queremos identificar, a nivel fisiológico, los genes claves en la regulación de estos cambios transcripcionales. Se sabe que las proteínas caudal-related homeobox (Cdx) son factores de transcripción que están implicados en el control de la arquitectura de los órganos durante el desarrollo, por lo que es probable que la morfogénesis del intestino y del riñón en el pez cebra sea también controlada por proteínas Cdx (Davidson y Zon, 2006 )

2-Análisis de la división celular asimétrica en células madre durante la tubulogénesis renal y en enfermedades renales.


La división celular asimétrica en células madre es esencial para la generación de la diversidad celular durante el desarrollo, así como para el mantenimiento de la homeostasis del tejido epitelial. Los defectos en la división asimétrica pueden contribuir a la aparición de cáncer o a la degeneración y envejecimiento tisular. De hecho, la división asimétrica es controlada por el mecanismo implicado en la orientación del huso mitótico, y en modelos de invertebrados, las proteínas de polaridad gobiernan la orientación del huso, pero su desregulación puede conducir a la iniciación del tumores (Martin-Belmonte y Pérez-Moreno, 2012). Sin embargo, la falta de un modelo vertebrado adecuado de estudio ha tenido limitada la investigación en este campo durante los últimos años.

 El objetivo de nuestro trabajo es investigar el patrón de división de las células madre renales durante el desarrollo a través de la generación de un sistema innovador de tubulogénesis en 3D que debería recrear los aspectos esenciales del proceso de nefrogénesis en los vertebrados. Tal sistema, con un nivel de complejidad similar al del órgano adulto, debería sortear las limitaciones de la utilización de los modelos in vitro e in vivo actuales, lo que facilitaría el análisis de las células madre y el estudio de su comportamiento durante la división asimétrica. Mediante el uso de este nuevo sistema 3D, nuestro objetivo es determinar si las células madre renales sufren división asimétrica durante la tubulogenesis renal y analizar los mecanismos moleculares implicados. Un objetivo fundamental del proyecto es descubrir los mecanismos de polaridad celular que gobiernan división de las células madre.

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Formación de túbulos epiteliales in vitro cultivados en micropatterns. Los micropatterns nos perminten cultivar células que se adhieren al sustrato en un patrón determinado. Los micropatterns presentan a las células diferentes moléculas a las que las se pueden adherir, permitiendo que las células crezcan formando un patrón que hemos definido. Gracias a este sistema estamos desarrollando diferentes tipos de cultivos que nos permiten construir túbulos epiteliales in vitro. Estos túbulos nos permiten probar el efecto de drogas en el epitelio renal de manera rápida y segura, así como estudiar procesos morfogenéticos de manera simplificada.

La caracterización de los mecanismos moleculares que regulan la división de las células madre en los riñones de los mamíferos será relevante no sólo para la comprensión de los procesos de desarrollo sino que también tendrán importancia clínica por su posible uso terapéutico. De hecho, es importante tener en cuenta la importancia de estos procesos en enfermedades tales como cáncer y enfermedades renales genéticas. Las anomalías congénitas en los riñones y el tracto urinario aparecen en 1 de 500 seres humanos, en última instancia, constituyendo aproximadamente el 20 al 30% de todas las anomalías prenatales, representando una de las principales causas de insuficiencia renal en lactantes y niños. De hecho, otro objetivo fundamental de este proyecto es investigar si el patrón de división de las células progenitoras de la nefrona renal se ve afectada en enfermedades genéticas como la enfermedad renal poliquística, y cómo estos defectos afectan el proceso de tubulogenesis 3D. Estamos particularmente interesados ​​en aquellas enfermedades renales genéticas que muestran defectos en el desarrollo del riñón que conducen a letalidad embrionaria y que, por tanto, no se puede modelar en animales.


Publicaciones destacadas:

  • DBañon, I; Gálvez, M.A., Vergarajauregui, S; Bosch, M; Borreguero-Pascual, A and Martín-Belmonte F. (2013) The control of IQGAP membrane localization by EGFR regulates mitotic spindle orientation during epithelial morphogenesis. EMBO J (in press).
  • Gálvez, M.A., Rodríguez-Fraticelli, AE; Vergarajauregui; Bañon, I, Bernascone, I; Fukuda, M; Mostov, KE and Martín-Belmonte F. (2012) Synaptotagmin-Like Proteins Control Formation of a Single Apical Membrane Domain in Epithelial Cells. Nature Cell Biol 14(8):838-49.
  • Rodríguez-Fraticelli AE; Auzan, M; Alonso, MA; Bornens, M and Martín-Belmonte, F. (2012) Cell confinement controls centrosome positioning and lumen initiation during epithelial morphogenesis. J Cell Biol 17;198(6):1011-23
  • Rodríguez-Fraticelli AE, Gálvez, M.A., Mostov K. Martín-Belmonte F. (2010) ITSN2 is a RhoGEF specific for Cdc42 that controls lumen formation in epithelial morphogenesis. J Cell Biol 189 (4):725-38.
  • Martín-Belmonte, F., Gassama, A., Datta, A., Yu, W., Rescher, U. Gerke, V. and Mostov, K. (2007). PTEN-Mediated Apical Segregation of Phosphoinositides Controls Epithelial Morphogenesis through Cdc42. Cell 128(2):383-97

 

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