Cabecera 2019 CBMSO CSIC UAM

Miércoles, 18 de Septiembre de 2019
    MICROSCOPÍA ÓPTICA Y CONFOCAL
 

Coordinador Científico:
Fco. Javier Díez-Guerra
Responsable Técnico:
Ángeles Muñoz

 

Microscopía Óptica y Confocal

 

SMOC

 

Comunidad de Madrid

 

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CONFCAL META: El escáner no funciona correctamente. Equipo fuera de servicio. (25-07-19)

 

ENLACES - PROTOCOLOS - TEJIDOS

 

  • Artículo con protocolos para teñir cortes de tejido de gran grosor
  • Artículo con protocolos para teñir cortes de tejido
  • Métodos Sigma
  • Enlaces a páginas sobre inmunohistoquímica
  • Immunohistochemistry (Current Protocols in Immunology)
  • Maity, et al. (2013). Immunostaining: Detection of Signaling Protein Location in Tissues, Cells and Subcellular Compartments. Methods in Cell Biology. 113, 81-105
  • Protocolos/Clarificación de muestras
  • Servicio de Histología del CNB para la realización de los cortes tejido
  • Fijación
    1. Sumergir los cortes de tejido en 4% paraformaldehido en 0.1 M cacodilato sódico, pH 7.3 a 4ºC durante al menos 8 horas. Se puede guardar el tejido en estas condiciones durante un par de semanas
    2. Lavar un par de veces, cambiando cada 10 minutos, con 0.1 M cacodilato sódico
    3. Transferir a PBS pH 7.3 y realizar varios lavados, incluso toda la noche
  • Inmunofluorescencia

    A ser posible desarrollar estos pasos con los cortes flotantes y en agitador giratorio.

    1. Utilizar alguno de los métodos para eliminar autofluorescencia ->VA A PROTOCOLOS>AUTOFLUORESCENCIA, CAMBIARLO
    2. Incubar con PBS/0.1% Tritón X-100 durante 15' a temperatura ambiente (RT)
    3. Incubar con solución de bloqueo (1% suero en PBS/0.1% Tritón X-100) durante 1-2 horas a RT
    4. Incubar con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC diluído en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC. Para secciones de más de 50 micras es posible prolongar la incubación durante dos noches haciéndolo a RT. En tal caso añadir 0.02% de "sodium azide"
    5. Lavar con PBS (5x5')
    6. Incubar con el anticuerpo secundario durante 12-18 horas a RT en oscuridad, diluído en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC
    7. Lavar con PBS/0.1% Tritón X-100 durante 1 hora con cambios frecuentes
    8. Lavar con PBS durante otra hora con cambios frecuentes. Los cortes se pueden guardar en PBS o paraformladehido 4% durante varios días. Es preferible no pasar al paso siguiente hasta que no se vayan a observar
    9. Cubrir los portas con medio de montajey colocar un cubre encima
  • Tinción de Tejidos con DAB
    1. Todo el proceso se realiza con los cortes de tejido (50-100 µm) en suspensión
    2. Fijar en PFA 4% toda la noche a 4°C
    3. Lavar con PBS pH 7.4 (2x5')
    4. Incubar con PBS/0.1% Tritón X-100 durante 15'
    5. Incubar con H2O2 al 0.003% en PBS durante 30' a temperatura ambiente (RT) para reducir la actividad peroxidasa endógena
    6. Lavar con PBS (3x5')
    7. Incubar con solución de bloqueo (1% suero e n PBS/0.1% Tritón X-100) durante 15' a RT
    8. Incubar con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC diluído en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC
    9. Lavar con PBS (5x5')
    10. Incubar con el anticuerpo secundario acoplado a peroxidasa durante 1h a RT diluído en PBS/0.1% Tritón X-100. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC
    11. Lavar con PBS (5x5')
    12. Lavar con 100 mM Tris pH 7.6 (2x5')
    13. Revelar la reacción con 0.5-1 mg/ml DAB 3,3'-diaminobenzidine)+ 0.06% H2O2 en 100 mM Tris pH 7.6. No más de 10-15'
    14. La reacción se puede intensificar con NiCl2 y CoCl2 (1%) en 100 mM Tris pH 7.6.
    15. Parar la reacción añadiendo 0.05% Azida
    16. Lavar con PBS (3x5')

 

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