Protocolo de extracción de RNA (basado en protocolos de Flychip)

 


 

Este protocolo es el que actualmente está en uso en este servicio y el recomendado a los usuarios a seguir. Cualquier

otro protocolo de extracción de RNA es igualmente válido siempre teniendo en cuenta que todas las muestras a usar

en el experimento han de ser extraídas por un mismo método. En este caso el usuario deberá consultar y especificar

que método ha sido el empleado.

 


 

Notas previas:

 

1- Trabajando con RNA

A la hora de trabajar con RNA, deben tomarse las máximas precauciones para evitar contaminaciones con RNasas y la degradación del RNA. Es importante trabajar en un ambiente libre de RNasas, y debe tratarse todo el material para su eliminación. Deben usarse guantes a lo largo de todo el proceso.

Intentar trabajar lo más rápido posible, con el fin de evitar la degradación del RNA durante la manipulación.

Con el fin de obtener los mejores rendimientos, deben usarse muestras frescas como material de partida. Si es necesario acumular muestra, congelar las muestras tras su recogida en nitrógeno líquido y almacenarlas a -70 ºC. Una vez que las muestras han sido homogeneizadas en el Buffer de Lisis, pueden ser almacenadas a -70 ºC sin necesidad de congelación en nitrógeno líquido.

Es importante utilizar RNA purificado recientemente. El almacenamiento del RNA a -70 ºC evita su degradación.

Para acumular tejido de una forma eficaz previo a su extracción se recomienda  usar RNA later (ambión #7020). Este es un producto que permite el almacenamiento de muestras a 4ºC por una semana o un mes a -20ºC. Seguir instrucciones indicadas por el  fabricante.

 

2- Trabajando con embriones

 

Para embriones es necesario decorionizarlos antes de proceder a la extracción (de prot. de Ilan Davis).:

 

        1-Acumular embriones de platos de puesta con un pincel y pasarlos a una malla adecuada. Lavarlos exhaustivamente con agua conteniendo 0.05% Triton-X-100 (opcional) para remover todo el exceso de levadura.
       

        2-Decorionar in 50% lejía casera (2.5% sodium hypochlorite final conc.), sumergiendo la malla por 2-4 minutos agitando los embriones durante el proceso. Lavar abundantemente, bien en PBS/0.05% Triton-X-100 o en agua para eliminar la lejía. No dejar que los embriones se sequen en ningún momento. Colocarlos en un tubo de 1.5 ml y proceder con su extracción o almacenamiento (ver abajo sección discos/larvas).

 

 

3- Trabajando con discos/larvas

 

         Diseccionar en PBS y transferir el material directamente a un tubo que contenga RNA -Later en hielo. Si no se dispone de este, acumular en PBS frio. Una vez finalizada la disección hay varias opciones. Una es congelar en nitrógeno líquido y guardar a -70ºC hasta reunir la suficiente cantidad de muestra. Si por el contrario ya se va a proceder a su extracción, sustituir el PBS por TRIzol y proseguir. Alternativamente se puede sustituir el PBS por TRIzol, homogeneizar y  almacenar a -70ºC hasta su extracción definitiva.

4- Adultos

        Dormir moscas en CO2, seleccionar los individuos y colocarlos en un tubo de 1.5 ml. Añadir 300 microlitros de TRIzol y homogeneizar. Guardar a -70ºC hasta su extracción definitiva o proceder a su extracción definitiva.


Cantidades orientativas de RNA en Drosophila

material cantidad RNA total (microgramos)
1 disco ala    0.150
1 larva 4-6
1 adulto macho     4-6    hembra      6-8

notas:

Estas cantidades en microgramos son de RNA total sin limpiar y de carácter orientativo. La limpieza de este por medio de columnas (RNeasy, quiagen) suele reducir las cantidades a 2/3 ó 1/2 sin que se pierdan las características de la muestra.

Se asume que el porcentaje de RNA mensajero es de 1-2% del RNA total.

 


Extracción de RNA

 

 

Place sample on ice in a 1.5 ml tube and add up to 300µls TRIzol

 

Homogenise sample with Pellet Motor pestle for 30secs in short pulses. Avoid overheating sample.

 

Add further 700 µls Trizol to complete 1 ml. Sample can be stored at -80 ºC

 

Centrifuge at x13.000 rpm for 3´

 

Transfer supernatant to a fresh clean 1.5 ml tube

 

Add 0.2 volumes of chloroform (200 µls) and mix strongly for 15"

 

Incubate at room temperature (bench) for 2´-3´

 

Centrifuge at x13.000 rpm for 5´

 

Transfer upper phase to a fresh tube (avoid touching interphase!)

 

Add 0.7 volumes (of upper phase) of isopropanol (±350 µls)

 

Mix midly inverting tube for 10 times

 

Incubate at room temperature (bench) for 5´

 

Centifuge at x13.000 rpm for 5´

 

Remove supernatant with care of pellet at bottom of tube

 

Wash pellet with 1 ml of 70% ethanol/DEPC water

 

Centrifuge at x13.000 rpm for 10´

 

Air dry pellet (briefly) on bench

 

Resuspend in appropiate volume of DEPC water (for 15 flies ±30 µls)

 

(DEPC water heated at 55ºC helps to resuspension)

 

Measure concentration in spectrophotometer

 

Run 1 µl in 1% agarose gel

 

Store at -80ºC until use

 

 

 

RNAlater               Ambion                             #7020

TRIzol                    Invitrogen                         #1555596-018

Pellet Pestle            Sigma                               #Z359947-100EA

Pestle motor            Sigma                               #z35.997

Chloroform             Merck                               #1.02445

Isporopanol             Merck                             # 1.09634

Ethanol 95               Merck                              #20 824.365

DEPC                      Sigma                                #D5758

Agarose                   Sigma                              #A-6013

 


Copyright © 2004 [CBMSO]. Reservados todos los derechos.
Revisión: 12/08/04