Servicios científicos

Citometría de flujo

Responsable del servicio

Berta Raposo

Coordinador científico

María Luisa Toribio

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citometria (at) cbm.csic.es

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En el servicio de Citometría de flujo del CBM, nuestro personal proporciona apoyo científico-técnico en citometría de flujo, desarrolla y optimiza nuevas aplicaciones y realiza separaciones celulares.

La citometría de flujo es una herramienta analítica que permite discriminar partículas de diferente tamaño y color. Es una técnica analítica y/o preparativa basada en el análisis simultáneo de varios parámetros de naturaleza óptica, de forma rápida y sobre un gran número de partículas individualizadas. Este análisis se realiza sobre cada partícula a partir de la dispersión de la luz y de la emisión de fluorescencia de las partículas iluminadas por una fuente luminosa.

Los parámetros que pueden analizarse mediante citometría de flujo son: i) los relacionados con las características físicas de la partícula: tamaño y complejidad y ii) las diferentes fluorescencias asociadas a la partícula.

El análisis se realiza a tasas de miles de células/segundo, lo que permite obtener datos de gran fiabilidad estadística, así como identificar poblaciones representadas a baja frecuencia dentro de la población global.

Otra característica importante de la citometría de flujo es que el análisis se realiza en una suspensión de partículas, por lo que las partículas o células analizadas deben estar en suspensión y en forma de partícula única (célula).

Por último, es importante señalar que existe una restricción en cuanto al tamaño de las partículas analizadas, que debe estar comprendido entre 0,5 y 100um.

Vacío

Citometría convencional

FACSCalibur (Becton Dickinson) Características técnicas: Dotado de dos líneas láser: azul (488nm) y roja (633nm) con 4 detectores de fluorescencia independientes: 3 detectores para el láser de 488nm (azul): 530/30, 585/42, 670LP. 1 detector para el láser de 633 nm (rojo): 660/20. Software de adquisición: Cell Quest-Pro
FACSCanto A (Becton Dickinson) Características técnicas: Dotado de dos líneas láser: azul (488nm) y roja (633nm) con 6 detectores de fluorescencia independientes: 4 detectores para el láser de 488nm (azul): 530/30, 585/42, 695/40, 780/60 2 detectores para el láser de 633 nm (rojo): 660/20, 780/60 Software de adquisición: DiVA 8.0.1
FACSCanto II HTS (Becton Dickinson) Características técnicas: Tres líneas láser: azul (488 nm), rojo (633 nm) y violeta (405 nm) con 8 detectores de fluorescencia independientes y equipado con un sistema High Throughput Sampler Option (HTS) para la adquisición de muestras directamente desde placa multipocillo. 4 detectores para el láser de 488 nm (azul): 530/30, 585/42, 695/40, 780/60 2 detectores para el láser de 633 nm (rojo): 660/20, 780/60 2 detectores para el láser de 405 nm (violeta): 450/50, 575/26 Software de adquisición de adquisición: DiVA 8.0.1
FACSCanto II High (sólo tubos) (Becton Dickinson) Características técnicas: Equipped with a High Throughput Sampler Option (HTS) system for sample acquisition directly from multiwell plate. Tres líneas láser: azul (488 nm), rojo (633 nm) y violeta (405 nm) 8 detectores de fluorescencia independientes: 4 detectores para el láser de 488 nm (azul): 530/30, 585/42, 695/40, 780/60 2 detectores para el láser de 633 nm (rojo): 660/20, 780/60 2 detectores para el láser de 405 nm (violeta): 450/50, 605/10 Software de adquisición: DiVA 8.0.1

Citometría espectral

AURORA 4L (Cytek)
Configuración óptica: 4L (16V-14B-10YG-8R)
4 líneas láser y 48 detectores: 16 detectores para el láser violeta (405nm), 14 detectores para el azul (488nm), 10 detectores para el verde amarillo (561nm) y 8 detectores para el rojo (633nm).
Características técnicas: Este equipo utiliza tecnología de espectro completo proporcionando una gran flexibilidad a los usuarios, permitiéndoles el uso de una amplia gama de fluorocromos combinándolos mucho más fácilmente que con otras tecnologías. Además, mejora la resolución de las poblaciones especialmente en muestras con alta autofluorescencia y/o bajos niveles de expresión de marcadores.
Este equipo está dotado además con un módulo de alta sensibilidad en el detector de SSC que permite resolver partículas de menor tamaño que otros equipos logrando separarlas más fácilmente del ruido electrónico. (ESP, Enhanced Small Particle Detector)

AURORA 5L ESP (Cytek)
Configuración óptica: 5L (16UV-16V-14B-10YG-8R)
4 líneas láser y 64 detectores: 16 detectores para el láser ultravioleta (355nm),16 detectores para el láser violeta (405nm), 14 detectores para el azul (488nm), 10 detectores para el verde amarillo (561nm) y 8 detectores para el rojo (633nm).
Características técnicas: Este equipo utiliza tecnología de espectro completo proporcionando una gran flexibilidad a los usuarios, permitiéndoles el uso de una amplia gama de fluorocromos combinándolos mucho más fácilmente que con otras tecnologías. Además, mejora la resolución de las poblaciones especialmente en muestras con alta autofluorescencia y/o bajos niveles de expresión de marcadores.
Este equipo está dotado además con un módulo de alta sensibilidad en el detector de SSC que permite resolver partículas de menor tamaño que otros equipos logrando separarlas más fácilmente del ruido electrónico. (ESP, Enhanced Small Particle Detector)

Cell sorters

FACSAria Fusion (Becton Dickinson)
El BD FACSAria Fusion es un separador celular fácil de usar que permite la separación de un gran número de muestras de diferentes orígenes. Se instala en una cabina de bioseguridad de Clase II Tipo A2 equipada con un sistema integrado de contención de aerosoles que funciona de forma independiente. A continuación se detallan algunas características técnicas:
Equipada con cuatro láseres de excitación de 405, 488, 561 y 640 nm. 18 detectores (16 de fluorescencia + 2 de dispersión), de los cuales 5 son para el láser de 405 nm (450/40, 525/50, 610/20, 660/20, 710/50, 780/60) y 2 para el láser de 488 nm: 530/30, 695/20, 4 para el láser de 561 nm: 610/20, 670/14, 710/50, 780/60 y 3 para el láser de 640 nm: 670/30, 730/45, 780/60. También está equipado con un sistema de control de temperatura y agitación de muestras.

Estaciones de análisis y software

El servicio pone a disposición de los usuarios tres estaciones de análisis (Hewlett-Packard) equipadas con los siguientes programas para analizar datos de citometría e imagenes:

– Estación 1: FlowJo v10 y 7.6.5, Spectroflo3.3.1 (configuración de 4 o 5 L)

– Estación 2: FlowJo v10, Spectroflo 3.3. 1 (configuración de 4 L)

– Estación 3: FlowJo v10, Spectroflo 3.3.1 (configuración de 5 L), Gen5 y DIVA 9.
Además, el servicio pone a disposición de los usuarios una licencia del software on line OMIQ (una moderna plataforma de análisis de citometría de flujo basada en el uso de algoritmos matemáticos automatizados a la vez que permiten análisis clásico de gating manual.

Otros equipos

Cytation (Agilent)
Características técnicas: El citómetro multimodal Cytation 1 de BioTek combina imágenes de fluorescencia y campo claro de alto contraste con la detección multimodal convencional.
This microscope is equipped with a 4X objective, and 3 fluorescence lines:
– DAPI (EX 377/50 nm, EM 447/60 nm); LED 365 nm.
– GFP (EX 469/35 nm, EM 525/39 nm); LED 465 nm
– RFP (EX 531/40 nm, EM 593/40 nm); LED 523 nm
El Software de adquisición Gen5 simplifica la captura de imágenes y la lectura de placas.

eFlux Analyzer XF96 (Agilent)
Características técnicas: El analizador de flujo extracelular XF96 (Agilent-Seahorse) permite caracterizar el metabolismo energético de células cultivadas de forma no invasiva. El instrumento analiza el consumo de oxígeno (OCR) y la acidificación extracelular (ECAR, una medida indirecta de la producción de lactato) en placas de 96 pocillos. Nuestro servicio proporciona acceso al equipo, así como asistencia básica tanto en el diseño de experimentos como en el análisis de datos.

NanoSight NS300 (Malvern Panalytical)
Características técnicas: El NanoSight NS300 utiliza la tecnología de análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), que aprovecha las propiedades de la dispersión de la luz y el movimiento browniano para obtener mediciones de la concentración y la distribución de tamaños de partículas en suspensión líquida.
– Rango de tamaños: 10 – 1000 nm
– Rango de concentración: 106 – 109 partículas/ml
– Rango de control de temperatura: 5 °C por debajo de la temperatura ambiente hasta 50 °C
– Volumen mínimo de muestra: 250 µl
– Cámara: SCMOS
– Enfoque: Enfoque motorizado controlado por ordenador

Aplicaciones:
– Análisis molecular y de distribución de tamaño de partículas.