Bioingeniería de enzimas de levaduras para generar compuestos bioactivos
Resumen de Investigación:
Trabajamos con microorganismos de interés biotecnológico, básicamente hongos y levaduras, productores de compuestos bioactivos. Tratamos de conectar la generación de conocimiento con el desarrollo de aplicaciones biotecnológicas, y básicamente nos centramos en la caracterización de nuevas enzimas productoras de compuestos con interés industrial, el análisis de sus determinantes estructurales-funcionales, su mejora operacional utilizando herramientas de biología molecular y en la obtención y caracterización de nuevas moléculas de posible utilidad industrial. Hemos patentado ya en distintos países la aplicabilidad industrial de la mayoría de las proteínas caracterizadas y diseñado métodos para su fijación a soportes sólidos.
Figura 1. Estructura 3D de la fructofuranosidasa Xd-INV de Xanthophyllomyces dendrorhous, una enzima productora del prebiótico neokestosa. Zoom: detalle del centro activo unido a neoerlosa (fructosil maltosa).
Figura 2. Substratos en el sitio activo de la Ffase. A. Las seis unidades de la molécula de inulina (izquierda) y fructosilnistosa (derecha) se representan con esferas. B. Moléculas de inulina (marrón) y fructosilnistosa (verde lima) representadas en stick superimpuestas.
Durante los últimos años hemos caracterizando nuevas proteínas de hongos y levaduras no convencionales (incluidas en los géneros Xanthophyllomyces, Schwanniomyces, Rhodotorula, etc.) con actividad glicosiltransferasa, aplicables en la producción de azúcares con propiedades prebióticas. En general, la mayoría son glicosilhidrolasas (GH) estructuralmente incluidas en las familias GH32, 31, 13 o 18. Hemos resuelto la estructura 3D de la primera proteína de levadura incluida en la familia GH32, asignado una función al dominio beta-sandwich que está presente en todos los miembros de la familia y probado que la oligomerización está implicada directamente en el reconocimiento del sustrato y especificidad. Hemos obtenido numerosas variantes enzimáticas que aumentan o alteran el patron de productos obtenidos en reacción biosintética. Recientemente, hemos conseguido que algunas de las enzimas caracterizadas glicosilaran compuestos con anillos aromáticos en su estructura, incluyendo los antioxidantes hidroxitirosol y pterostilbeno, lo que confiere un nuevo interés biotecnológico a nuestros biocatalizadores. Pretendemos ampliar nuestro estudio a hidrolasas incluidas en otras familias estructurales, incrementar/modificar sus propiedades biosintéticas, escalar su producción y la de los productos generados y validar la actividad biológica o darles nuevos usos a las moléculas obtenidas. Objetivos incluidos en los de los consorcios Glicoenz, Fish4Fish y un proyecto financiado por la Fundación Ramón Areces (XIX Concurso Nacional-Ciencias de la Vida y la Materia).
| Apellidos | Nombre | Laboratorio | Ext.* | Categoría profesional | |
|---|---|---|---|---|---|
| Barahona Pérez | Laura | 102 | 4521 | lbarahona(at)cbm.csic.es | Titulado Sup.de Actividades Técn. y Profes. GP1 |
| Fernández Lobato | María | 102 | 4492 | mfernandez(at)cbm.csic.es | Catedrático Universidad, GA |
| Gabdrashitova | Dana | 104 | 4504 | Estudiante | |
| Gracia Gómez | Beatriz | 102 | 4492 | Titulado Sup.Inv.y Laboratorio | |
| Martínez Ranz | María | 102 | 4521 | mmranz(at)cbm.csic.es | Titulado Sup.de Actividades Técn. y Profes. GP1 |
| Míguez Rodríguez | Noa | 102 | 4521 | noa.miguez(at)csic.es | Investigador Doctor |
| Minguet Lobato | Marina | 102 | 4521 | m.minguet(at)cbm.csic.es | Contrato Predoctoral |
| Narmontaite | Egle | 102 | 4521 | egle.narmontaite(at)cbm.csic.es | Contrato Predoctoral |
| Remacha Moreno | Miguel | 102 | 4521 | mremacha(at)cbm.csic.es | Catedrático Universidad, GA |
Publicaciones relevantes:
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Kidibule, P. E., Costa, J., Atrei, A., Plou, F.J. Fernández-Lobato*, M., Pogni*, R. Production and Characterization of Chitooligosaccharides by the Fungal Chitinase Chit42 Immobilized on Magnetic Nanoparticles and Chitosan Beads: Selectivity, Specificity and Improved Operational Utility” RSC Advances, 11, 5529-5536 (2021); (Published 25/01/2021). * Both corresponding authors. DOI: 10.1039/d0ra10409
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Rodrigo-Frutos, D., Jiménez-Ortega, E., Piedrabuena, D., Ramirez-Escudero, M., Míguez, N., Plou, F.J., Sanz-Aparicio, J., Fernández-Lobato, M. “New insights into the molecular mechanism behind mannitol and erythritol fructosylation by β-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis”. Scientific Report, 11, 7158 (2021); Open Access (Published: 30 March 2021) https://doi.org/10.1038/s41598-021-86568-6
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Gimeno-Pérez, M., Merdzo, Z., Castillo Rosa, E., Martin de Hijas, C., Fernández-Lobato, M. “The β-Fructofuranosidase from Rhodotorula dairenensis: Molecular Cloning, Heterologous Expression, and Evaluation of Its Transferase Activity”. Catalysts 11(4), 476 (2021) Open Access (07/04/2021); https://doi.org/10.3390/catal11040476
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Miguez, N., Kidibule, P., Santos-Moriano, P., Ballesteros, A.O., Fernandez-Lobato, M., Plou, F.J. “Enzymatic Synthesis and Characterization of Different Families of Chitooligosaccharides and Their Bioactive Properties” Applied Sciences 2021, 11, 3212 (Pub Date: 2021-04-03) https://doi.org/10.3390/app11073212.
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Piedrabuena, D., Rumbero, A., Pires, E., Leal-Duaso, A., Civera, C., Fernandez-Lobato, M.* Hernaiz, M.J.* “Enzymatic synthesis of novel fructosylated compounds by Ffase from Schwanniomyces occidentalis in green solvents”. RSC Advances, 2021, 11, 24312-24319.* Both corresponding authors. DOI: 10.1039/d1ra01391b
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Jiménez-Ortega, E., Kidibule, P.E., Fernández-Lobato, M. Sanz-Aparicio, J. “Structural inspection and protein motions modelling of a fungal Family 18 chitinase by crystallography depicts the molecular determinants of its dynamic enzymatic mechanism”. Computational and Structural Biotechnology Journal. 2021, 19, 2021, Pages 5466-5478. https://doi.org/10.1016/j.csbj.2021.09.027
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Rubio, C., Lizárraga, E., Alvarez-Cilleros, D., Pérez-Pardo, P., Sanmartin-Salinas, P., Toledo-Lobo, M.V., Alvarez, C., Escrivá, F., Fernández Lobato, M., Guijarro, L.G., Valverde, A.M., Carrascosa, J.M. “Aging in male Wistar rats associates with changes in intestinal microbiota, gut structure and cholecystokinin-mediated gut-brain axis function”. Journal Gerontology: Serie A, glaa313, Published 14 December (2020) https://doi.org/10.1093/gerona/glaa313
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Cervantes, F.V., Neifar, S., Merdzo, Z., Viña-Gonzalez, J., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A.O., Fernandez-Lobato, M., Bejar, S., Plou, F.J. “A Three-Step Process for the Bioconversion of Whey Permeate into a Glucose D-Free Tagatose Syrup” Catalysts, 10, 647 (2020); Open Access. https://doi.org/10.3390/catal10060647
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García-Gonzalez, M., Minguet-Lobato, M., Plou, F.J. Fernández-Lobato, M. “Molecular characterization and heterologous expression of two a-glucosidases from Metschnikowia spp, both producers of honey sugars”. Microbial Cell Factories, 19, 140 (pp 1-14), (2020); Open Access. https://doi.org/10.1186/s12934-020-01397-y
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Kidibule, P., E., Santos-Moriano, P., Plou, F.J., Fernández-Lobato, M. Endochitinase Chit33 specificity on different chitinolytic materials allows the production of unexplored chitooligosaccharides with antioxidant activity. Biotechnology Reports, 27, e00500 (pp 1-9). Open Access. (2020). DOI: 10.1016/j.btre.2020.e00500
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Rodrigo-Frutos, D., Piedrabuena, D., Sanz-Aparicio, J., Fernández-Lobato, M.. “Yeast cultures expressing the Ffase from Schwanniomyces occidentalis, a simple system to produce the potential prebiotic sugar 6-kestose. Appl. Microbiol Biotechnol. (2019). 103:279-289. doi:10.1007/s00253-018-9446-y
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Gutiérrez, M.S., Campusano, S., Gonzalez, A.M., Gómez, M., Barahona, S., Sepúlveda, D., Espenshade, P.J., Fernández-Lobato, M., Baeza, M., Cifuentes, V., Alcaíno, J. “Sterol Regulatory Element-Binding Protein (Sre1) promotes the synthesis of carotenoids and sterols in Xanthophyllomyces dendrorhous”. Front. Microbiol., (29 March 2019). Open Access .doi:10.3389/fmicb.2019.00586
-Santos-Moriano, P., Kidibule, P., Míguez, N., Fernández-Arrojo, L. Ballesteros, A.O., Fernández-Lobato, M., Plou, F.J. “Tailored enzymatic synthesis of chitooligosaccharides with different deacetylation degree and their anti-inflammatory activity”. Catalysts, 9(5), 405 (2019); Open Access. doi:10.3390/catal9050405 -
Garcia-Gonzalez, M., Plou, F.J., Cervantes, F.V., Remacha, M., Poveda, A., Jiménez-Barbero3, J., Fernandez-Lobato, M. “Efficient production of isomelezitose by a glucosyltransferase activity in Metschnikowia reukaufii cell extracts”. Microbial Biotechnology 12: 1274-1285 (2019); Open Access. DOI: 10.1111/1751-7915.13490
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Ramírez-Escudero, M., Miguez, N., Gimeno-Perez, M., Ballesteros, A.O., Fernández-Lobato, M., Plou, F.J., and Sanz- Aparicio, J. “Deciphering the molecular specificity of phenolic compounds as inhibitors or glycosyl acceptors of β-fructofuranosidase from Xanthophyllomyces dendrorhous”. Scientific Reports 9, 17441 (2019); Open Access. 25 Nov 2019. https://www.nature.com/articles/s41598-019-53948-y
Tesis doctorales:
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Zoran Merdzo Kunovac (2021) Estudio de la α-glucosidasa de Schwanniomyces occidentalis para su aplicación en la síntesis de isomaltooligosacáridos y otros compuestos glucosilados. UAM
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Ángel García Horstmann (2021) Estudio de microorganismos halófilos moderados productores de exopolisacáridos pertenecientes a salinas de interior en Castilla-La Mancha. (UAM). Doctorado Industrial
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Peter Elias Kidibule(2021) Using chitinolytic materials to obtain bioactive oligosaccharides. Characterization of biocatalysts and products. UAM. Doctorado Internacional.
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María Gimeno-Pérez (2019) Estudio estructural de la β-fructofuranosidase de Xanthophyllomyces dendrorhous y su empleo para la producción de oligosacáridos prebióticos y otros dereivados fructosilados. UAM
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Patricia Gutiérrez Alonso (2013) Caracterización de dos glicosiltransferasas de oligosacáridos prebióticos de las levaduras Phaffia rhodozyma y Rhodotorula dairenensis. UAM
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Miguel Antonio de Abreu Felipe (2011) Studies aimed at improving the funtionality of non-conventional yeast enzymes able to synthesize prebiotic oligosaccarides. UAM. European Program
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Miguel Álvaro Benito (2011) The study of β-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis reveals new functional elements in the family GH32 of glycosyltransferases and an unconventional genetic code use in this yeast. UAM. European Program
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María Dolores Linde López (2010) Caracterización Bioquímica, molecular y estructural de una b-fructofuranosidasa con capacidad transferasa de la levadura Phaffia rhodozyma aplicable a la producción de oligosacáridos prebióticos. UAM
GLYCOENZ-PHARMA (PID2019-105838RB-C3): "A platform for the design of efficient biocatalysts in the synthesis of compounds with pharmacological activity“.
Funding organization: Spanish Ministry od Science and Innovation
COVTRAVI-19-CM: “Plataformas y modelos preclínicos para el abordaje multidisciplinar en covid-19 y en respuesta a futuras pandemias”.
Financiador: Comunidad de Madrid y fondo europeo de desarrollo regional
FISH4FISH-863697: "FISH chitinolytic biowastes FOR FISH active and sustainable packaging material“. Funding organization: EMFF programme of the European Union
ARECES-2018: "Producción de prebióticos de segunda generación y glicósidos de polifenoles. Validación de sus propiedades bioactivas para su empleo en alimentación funcional“.
Funding organization: Fundación Ramón Areces
GLICO-BIOCAT: BIO2016-76601-C3: "Glycobiocatalysis: screening and molecular design of novel glycosidic enzymes and their application to the synthesis of bioactive oligosaccharides and glycoconjugates“.
Funding organization: Ministerio de Economía, Industria y Competitividad:
Patentes:
- P200402994. New enzyme for the prebiotic production: WO 2006/064078 A1; PCT-ES2005/070177; Europa No 05825223.0. Primer premio a la mejor patente Madrid+d 2008.
- P200501875. New fructofuranosydase for prebiotic oligosaccharides obtaining: PCT-ES2006/000435. Europa Nº 06807883.1; USA No. 11/997.233
- P200503195. “New fructofuranosydase for the 6-kestose production: PCT-ES2006/000693; Europea No. 06841745-0; USA No. 12/159.164; Japón No. 2008-547993.
- P200930001. Biocatalizador inmovilizado basado en alginato para la biotransformación de carbohidratos: PCT-ES2010/070104
