• Es conveniente consultar los patrones de excitación y emisión de los fluoróforos y proteínas fluorescentes con el fin de optimizar el método de adquisición.
• Cuando uséis una proteína fluorescente (FP) por primera vez conviene comprobar su espectro de emisión, por detección espectral, para garantizar la identidad de la proteína.
• Si se usa la línea 405 nm en muestras que contengan una FP, conviene descartar problemas de fotoconversión (cambio de los perfiles de emisión).

• Haceros la pregunta ¿lo que veo al ocular es suficiente para sacar las conclusiones que necesito en mi experimento? Si la respuesta es SI, no es necesario tomar las imágenes en un equipo confocal. Ahorraréis tiempo y dinero.

• Para usar objetivos de inmersión la muestra tiene que estar montada sobre cristal de 0,17 mm de espesor (Nº 1.5) o polímero de características ópticas óptimas para microscopía de alta resolución. Si usamos placas de plástico restringiremos la toma de imágenes a objetivos de larga distancia (secos).
• En experimentos de súper resolución la muestra ha de estar montada sobre cristal de 0,17 mm de espesor de alta calidad (Nº 1.5H).
• Si la muestra es fijada, montada con medio de montaje, emplearemos objetivos de aceite (índice de refracción RI = 1.518).
• Si la muestra está viva o inmersa en medio líquido usaremos aceite W (RI = 1.334), o aceite de silicona (RI = 1.406) especialmente si la muestra es gruesa.

• Es importantísimo llevar controles para asegurarnos que la tinción es específica:
  • Tinción únicamente con el anticuerpo secundario (si el experimento no lleva un control negativo interno).
  • Tinciones individuales, especialmente en experimentos de colocalización.
  • Autofluorescencia.

• En experimentos de colocalización usaremos siempre los canales verde y rojo. En caso de colocalizar un tercer canal incluiremos el rojo lejano. Evitaremos siempre canales cercanos al UV por posibles aberraciones cromáticas.
• El tamaño del pixel debería ser acorde al criterio de Nyquist (https://svi.nl/NyquistCalculator). El SMOC dispone de una tabla para sus equipos.
• Es conveniente hacer la deconvolución posterior de las imágenes.

• Encenderemos los láseres (equipos confocales) o la lámpara de fluorescencia (equipos de campo ancho) una hora antes de tomar las imágenes. En los equipos modernos con láseres de estado sólido, o equipos de campo ancho con LEDs bastará con encenderlos 10 minutos antes.
• Todas las imágenes se tomarán el mismo día. En caso de no poder hacerlo se irán tomando tandas de todas las condiciones.
• Adquiriremos las imágenes a 12 bits, mínimo.
• Evitar la saturación de la señal y el photobleaching de la muestra.

• El medio de cultivo de las células no debe contener rojo fenol para evitar fondo y fototoxicidad. Es conveniente haber cultivado las células en este tipo de medio previamente. También es recomendable disminuir la concentración de suero en el medio, siempre que no se vean alterados el crecimiento y viabilidad celular.
  En el mercado existen multitud de medios formulados específicamente para microscopía, por ejemplo LiveLight^TM (Cell Guidance Systems) o Live Cell Imaging Solution (Invitrogen).
• En estudios de larga duración se sacrificará la calidad de imagen (menor resolución, mayor ganancia, menor iluminación…) con el fin de disminuir los tiempos de exposición y evitar la muerte de la muestra.
• En el caso de necesitar imagen confocal, se elegirá un equipo con detectores de alta sensibilidad, escaneo a alta velocidad y mantenimiento de foco por hardware, siempre que sea posible.
• Es conveniente que la placa esté colocada en el microscopio al menos 30 minutos antes de comenzar el experimento.
• En experimentos de larga duración se recomienda colocar una membrana de teflón (FoilCover de PeCon) para evitar la evaporación del medio. También se pueden emplear aceites anti-evaporación del tipo Ibidi Ref. 50051 o Sigma-Aldrich Ref. 5310 (este último empleado fundamentalmente en la preparación de muestras de embriones).
• Para evitar photobleaching se puede añadir un anti-fading del tipo ProLong Live (Invitrogen) o medios especiales como DMEM^gfp-2 (Evrogen).
• Para la eliminación de fondo se puede añadir BackDrop (Invitrogen), o similares.
• En ausencia de un sistema de control de CO2 en el microscopio se añadirá HEPES 20mM al medio de cultivo con el fin de mantener el pH. En el mercado existen multitud de medios ya formulados como Leibovitz's L-15 (ofrecido por diversas marcas), CO2 Indpendent Medium (Gibco) u Opti-KlearTM (Marker Gene Technologies), entre otros.

• Componentes celulares que generan autofluorescencia

Paraformaldehido 4% (PFA 4%)

Es un buen método de fijación para las inmunofluorescencias. La integridad estructural de la célula no queda tan bien como con el glutaraldehido pero los sitios antigénicos generalmente no se ven muy afectados y además genera muy poca autofluorescencia.

• Preparación:
  1. Disolver paraformaldehido al 4% (= 10% formalina) en agua destilada precalentada a 55-60ºC
  2. Añadir unas gotas de NaOH 1M y agitar hasta disolver totalmente
  3. Enfriar hasta temperatura ambiente (RT). Añadir PBS hasta 1X y llevar el pH a 7.4
  4. Utilizar esta solución fresca no más de 1 semana a RT (se puede congelar en alícuotas a -20ºC por varios meses)

• Uso:
  1. Lavar los cubres con PBS y fijar 15' con PFA 4% añadiéndolo lentamente
  2. Lavar los cubres con PBS (3x5')
  3. Guardar los cubres fijados a 4ºC en PBS con 0.01 % Azida o comenzar la inmunofluorescencia

Formaldehido- Acetona

• Uso:
  1. Lavar los cubres con PBS a 37ºC
  2. Fijar las células con PFA 4% en PBS durante 10' a RT
  3. Lavar las células con PBS (3x5')
  4. Permeabilizar las células con acetona a -20ºC durante 10'. Desarrollar la incubación a -20ºC
  5. 5. A continuación: a) Secar los cubres y guardarlos a 4ºC o b) rehidratarlos con PBS durante 10' a RT y comenzar la inmunofluorescencia

Formalina (Formalin solution, Sigma- HT501128)

• Uso:
  1. Lavar los cubres con PBS y fijar durante 20' con formalina añadiéndolo lentamente
  2. Lavar los cubres con PBS (3x5')
  3. Guardar los cubres fijados a 4ºC en PBS con 0.01 % Azida o comenzar la inmunofluorescencia

Metanol

Es un buen método de fijación si queremos mantener la integridad estructural de la célula, aunque los sitios antigénicos de unión al anticuerpo pueden verse dañados. Además, para una permeabilización efectiva puede ser necesario el uso de un detergente aniónico.

• Uso:
  1. Lavar los cubres con PBS.
  2. Añadir Metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'
  3. Retirar el Metanol, rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluorescencia directamente con la incubación del anticuerpo primario

Acetona

Con esta fijación se preservan muy bien los sitios antigénicos de unión al anticuerpo y la cantidad de fluorescencia de fondo que se genera es muy baja. Sin embargo, la integridad estructural de la célula desaparece, aunque cuando son visualizadas en widefield la estructura permanece suficientemente intacta como para analizar la localización subcelular de la proteína de interés. Sin embargo, cuando se intenta hacer un estudio en 3D mediante microscopía confocal se aprecia que las células fijadas mediante acetona han perdido su tridimensionalidad. La estructura celular, al contrario que la fijación por metanol, no es visible a través de luz transmitida. La acetona es un buen agente permeabilizador por lo que el tratamiento posterior con detergente no es necesario.

• Uso:
  1. Lavar los cubres con PBS
  2. Añadir Metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 10'
  3. Lavar las células con PBS (3x5')

Acetona-Metanol

Un buen compromiso entre la naturaleza destructiva de la acetona y la falta de marcaje procedente del metanol es usar la combinación acetona-metanol. A menudo, suele ser una buena idea empezar con una relación 50:50 aunque hay que buscar la mejor relación (en algunos casos esta es acetona: metanol 20:80)

• Uso:
  1. Lavar los cubres con PBS
  2. Añadir acetona:metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'
  3. Retirar la mezcla y rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluorescencia a partir de la incubación con el anticuerpo primario

Glutaraldehido

Es el método estándar de fijación para microscopía electrónica. Preserva muy bien la estructura, pero desafortunadamente la mayor parte de los sitios de unión al anticuerpo los destruye generando, además, en las células fijadas mucha autofluorescencia. Incubando las células fijadas con una solución de Borhidruro de Sodio durante varios minutos puede disminuir la cantidad de autofluorescencia que se genera en la fijación. Una buena solución puede ser emplear una combinación de glutaraldehido 0.25% con paraformaldehido.

ANTES DE NADA SE DEBERÍAN REALIZAR TRES TIPOS DE CONTROLES:

1. AUTOFLUORESCENCIA:
   
   Desarrollando el mismo protocolo pero sin anticuerpos primario y secundario.
   
   
2. ANTICUERPOS SECUNDARIOS:
   
   Incubando la muestra sólo con cada uno de los anticuerpos secundarios.
   
   
3. CRUCE O INTERFERENCIA DE CANALES:
   
   Incubando con cada una de las combinaciones de anticuerpo primario y secundario por separado.
   Para comprobar el cruce de canales en estas muestras se usarán las condiciones de la muestra problema (con todos los canales).
   
   INCUBACIÓN SIMULTÁNEA FRENTE A LA SECUENCIAL:
   Aunque la incubación simultánea en un mismo paso con los anticuerpos primarios por un lado y los secundarios por otro es más rápida y cómoda, es preferible incubar secuencialmente, primero con uno de los primarios y después con su secundario correspondiente. Así sucesivamente con todos los demás..

1. Es conveniente testar varios medios de montaje ya que puede ocurrir que disminuyan o incluso desaparezca la señal de algún canal simplemente por utilizar un medio incompatible con el marcaje que estamos realizando.
2. Para análisis 3D el medio de montaje empleado no debe endurecer.

Lavado previo de los cubres

1. Calentar los cubres en agitador a 50-60ºC sumergidos en 1M HCl durante 4-16 horas.
2. Dejar enfriar.
3. Lavar mucho con agua destilada realizando muchos cambios.
4. Pasarlos por 95% etanol y dejar secar sobre papel de filtro whatman.
5. Esterilizar con luz U.V. antes de cultivar las células.
6. En ocasiones,  es necesario tratar los cubres para el crecimiento celular. Hay algunos ejemplos de protocolos y productos de casas comerciales que podemos utilizar:
   
   
   • http://spectorlab.labsites.cshl.edu/protocols/
   • CyGEL™
   • Extracellular Matrix (ECMs)
   • HistoBond®+S láminas portaobjetos adhesivas
   • Matrices extracelulares (ECM)
   • https://www.cultek.com/catalogsearch/result/?q=matrices+extracelular

• Fiji / ImageJ
• Plugins ImageJ
• Ilastik
• CellProfiler
• ZEN / Image Browser (Zeiss)
• NIS-Elements Viewer (Nikon)
• CellSens (Olympus)
• LAS X (Leica)
• NeuronStudio
• Abrir imágenes SPINSR10 (Olympus)

• Bioimage Data Analysis Workflows

• Stiching de Imágenes en FIJI
• Trazado Neuritas & Análisis Sholl
• Visualizadores 3D Avanzados de Pago
• Visualizadores 3D Gratuitos
• Análisis 3D mediante Object analyzer (Huygens)
• Sistemas de perfusión disponibles en el SMOC
• MultiTime Serie (Zeiss)
• FRET GFP-mCherry
• FRET CFP-YFP

• Fluorescent Proteins and Related Assays (12-12-2016, actualizado 17-02-2021)
• Fluorescence Quantification with Fiji (02-12-2016)
• A basic guide of ImageJ/Fiji particle counting tools (30-10-2015)
• A general view of the basic Fiji/ImageJ tools (14-8-2015)
• Introduction to image processing and object segmentation using Fiji/ImageJ (12-6-2015)
• Seminario Colocalizacion Cuantitativa (Noviembre-2014)
• Seminario ImageJ-contaje de partícula (Septiembre-2012)

• Iniciación al uso de Macros en Fiji