Microscopía Óptica y Confocal

Microscopía óptica y confocal

Últimas noticias

SPINSR (Olympus),NO funciona la Adquisición Simultánea (11.06.2021).
Confocal LSM 510 vertical instalado en el cuarto 335. (23-09-2021)
Se está instalando un nuevo confocal vertical LSM900 (22-09-2021)
Confocal LSM 510 invertido dado de BAJA. Ya no está disponible (21-09-2021)
Tarifas 2021 vigentes del SMOC (01-03-2021)

Coordinador científico: Francisco Javier Díez-Guerra

Responsable del servicio: Ángeles Muñoz

confocal-cbm (at) listas.csic.es

Tercera planta - 310

El Servicio de Microscopía óptica y confocal (SMOC) se ocupa desde 1999 del mantenimiento y la gestión de uso del equipamiento común de microscopía óptica avanzada del CBMSO. Ofrece también soporte, asesoramiento y formación en técnicas de microscopía óptica y análisis de imagen, distribuye reactivos y materiales relacionados con la microscopía, y se encarga de buscar recursos para adquirir equipamiento que se adecúe a las demandas de los investigadores del CBM.

El SMOC, como servicio científico central del Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa", no desarrolla ninguna labor de investigación científica y ofrece:

Equipamiento compuesto por 7 sistemas de microscopía confocal y 6 microscopios de campo ancho, con distintos niveles de automatización, que permiten realizar estudios en muestras vivas y fijadas. Además, dispone de 2 estaciones de trabajo para análisis de imagen, un vibrátomo y un estereomicroscopio.
Un sistema on-line de acceso y gestión de las reservas de los equipos y su facturación.
Un stock de reactivos y materiales relacionados con la microscopía
Un sistema de Garantía de la Calidad desde marzo de 2009, actualmente con Certificación AENOR en la Norma ISO 9001-2015.

El SMOC:

Tiene una base de 300 usuarios anuales pertenecientes a más de 90 grupos de investigación del CBM y otros organismos de investigación públicos y privados.
Acredita una utilización de sus equipos superior a 12.000 horas al año.
Organiza seminarios formativos teóricos y prácticos.
Pertenece a la Red Española de Microscopía Óptica Avanzada (REMOA), a la Red de Laboratorios e Infraestructuras (RedLab) de la Comunidad de Madrid (CM) (Laboratorio nº216) desde 2007 y a la Plataforma de Microscopía para Biociencias de la RedLab de la CM creada en 2012.

* Para llamadas desde el exterior a la extension xxxx se debe marcar: 34 91196xxxx
Apellidos	Nombre	Laboratorio	Ext.*	Horario	e-mail	Categoría profesional
Calvo Cazalilla	Elena	310	4643	9:00 - 16:30	elena.calvo@cbm.csic.es	Tco. Sup.Investig. y Laboratorio, GP3
Gallego García	Carlos	310	4643	8:00 - 15:30	cgallego(at)cbm.csic.es	Tit.Sup.Activ.Técn.y Profes. GP1
Muñoz Alcalá	Mª Angeles	310	4643/4613	9:00 - 16:30	mamunoz(at)cbm.csic.es	E.Ayudantes De Invest. De Los Oo.Publicos De Investigacion
Sánchez Jiménez	Carmen	310	4643	9:30-17:00	csjimenez(at)cbm.csic.es	Titulado Sup.de Actividades Técn. y Profes. GP1
Vega Sabugo	Francisco José	310	4643	9:30 - 17:00	fjvega(at)cbm.csic.es	Titulado Sup. Actividades Tecn. y Prof.GP1
Villalba Villacorta	María Teresa	310	4643	8:00 - 15:30	tvillalba(at)cbm.csic.es	Ayudante Investigación

Microscopios Widefield

Cámara sCMOS-monocroma

Ubicación: 3ª Planta (Lab. 310)

Sistema in vivo compuesto por microscopio invertido Axiovert200 (Zeiss) acoplado a una cámara sCMOS monocroma

Reservar

Características Técnicas

MANUAL DE USO (Disponible en "Documents" del sistema de Reservas)

Calibrar Imágenes: Relación tamaño pixel/µ

Deconvolución: Valores necesarios para una correcta adquisición

F.R.E.T

Ubicación: 3ª Planta (Lab. 310)

Equipo FRET in vivo compuesto por microscopio invertido Axiovert200 (Zeiss) acoplado a una cámara ccd monocroma y cambio ultrarrápido de filtros

Reservar

Características Técnicas

MANUAL DE USO (Disponible en "Documents" del sistema de Reservas)

Calibrar Imágenes: Relación tamaño pixel/µ

Deconvolución: Valores necesarios para una correcta adquisición

Sistema in vivo de alta velocidad

Ubicación: Lab. 423.a

Microscopio AF6000 LX de Leica

Reservar

Características Técnicas

MANUAL DE USO (Disponible en "Documents" del sistema de Reservas)

Calibrar Imágenes: Relación tamaño pixel/µ

Programa para procesar archivos de equipos de Leica

Deconvolución: Valores necesarios para una correcta adquisición

Mediciones de calcio

Cámara CMOS-color

Ubicación: 3ª Planta (Lab. 335)

Microscopio vertical Axioskop2 plus (Zeiss) acoplado a cámara DMC6200 (Leica)

Reservar

Características Técnicas

MANUAL DE USO (Disponible en "Documents" del sistema de Reservas)

Calibrar Imágenes: Relación tamaño pixel/µ

Cámara CoolSNAPfx - monocroma

Ubicación: 3ª Planta (Lab. 335)

Microscopio vertical Axio Imager M1 (Zeiss) acoplado a cámara ccd Coolsnap FX monocroma

Reservar

Características Técnicas

MANUAL DE USO (Disponible en "Documents" del sistema de Reservas)

Calibrar Imágenes: Relación tamaño pixel/µ

Microscopios Confocales

Workstations

Equipamiento adicional

Objetivos especiales

Reactivos disponibles en el Servicio de Microscopía Confocal

Reactivos disponibles en el Servicio de Microscopía Confocal

Reactivos disponibles en el Servicio de Citometría

Controles esenciales y obligatorios en microscopía

Excitación/emisión fluoróforos y proteínas fluorescentes

Recomendaciones generales

Fluoróforos y proteínas fluorescentes

Es conveniente consultar los patrones de excitación y emisión de los fluoróforos y proteínas fluorescentes con el fin de optimizar el método de adquisición.
Cuando uséis una proteína fluorescente (FP) por primera vez conviene comprobar su espectro de emisión, por detección espectral, para garantizar la identidad de la proteína.
Si se usa la línea 405 nm en muestras que contengan una FP, conviene descartar problemas de fotoconversión (cambio de los perfiles de emisión).

¿Confocal o campo ancho?

Objetivos, aceites y montaje de las muestras

Controles en mi experimento

Experimentos de colocalización

Cuantificación de fluorescencia

Estudios de muestra viva

Manuales y seminarios SMOC

Vídeos de análisis/tratamiento imagen (SMOC)

Automatización de tareas (MACROS)

Servicio de Microscopía Optica y Confocal (Lab.310)

Centro de Biología Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM)

C/Nicolás Cabrera,1

Universidad Autónoma de Madrid. Cantoblanco.

28049. Madrid

Teléfonos:

Despacho: 91 196 4613

Laboratorio 310: 91 196 4643

Laboratorio 336: 91 196 4660

Fax. 91 196 4420

E-mail: confocal-cbm@listas.csic.es

SMOC en 3 plantab 1

Transporte en la Comunidad de Madrid

Transporte en la U. Autónoma de Madrid

RENFE

Líneas C7, C8 y C10 de Cercanías: Parla-Atocha-Chamartín-Cantoblanco-Alcobendas/S.S. de los Reyes o Colmenar Viejo.

Estación de Cantoblanco.

AUTOBUSES INTERURBANOS

Líneas 714, 827, 827B y 828

METRO DE MADRID Y LÍNEAS DE AUTOBUSES EMT

Protocolos

Autofluorescencia

Componentes celulares que generan autofluorescencia

Métodos para eliminar la autofluorescencia

Borohidruro sódico
- Tratar los cubres fijados con NaBH₄ (1 mg/ml en PBS pH 8.0) durante 10 minutos a temperatura ambiente
- Lavar con PBS y proseguir con el protocolo usual de inmuofluorescencia. Esta solución debe estar recién preparada, observándose la formación de burbujas.
Toluidine blue
En caso de que sea el FITC el método de detección y fundamentalmente para tejidos:
- Incubar el tejido en 0.1% Toluidine Blue (Sakai, 1973. Stain Technology 48: 247-249) desde varias horas hasta toda la noche
- Lavar el exceso de solución. Esto disminuirá la autofluorescencia debida principalmente a la clorofila y a las paredes celulares (elastina/colágeno esencialmente)
Cloruro amónico
- Tratar los cubres fijados con NH4Cl (50mM diluído en PBS pH 8.0) durante 10 minutos a temperatura ambiente
- Lavar con PBS y proseguir con el protocolo usual de inmuofluorescencia
Sudan Black
- Tratar los cubres después de incubar con los anticuerpos secundarios con 0.3% Sudan Black (w/v) in 70% ETOH (v/v) durante 10 minutos
- Lavar bien con PBS y montar la preparación
Trypan Blue
- Tratar los cubres después de incubar con los anticuerpos secundarios con Trypan Blue 250ug/ml, pH 4.4 en PBS durante 1 minuto
- Lavar bien con PBS y montar la preparación

Productos comerciales

Artículos

ARTÍCULO	FUENTE
"Characterizing and Diminishing Autofluorescence in Formalin-fixed Paraffin-embedded Human Respiratory Tissue"	Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2014, Vol. 62(6) 405–423
"Simple Method for Reduction of Autofluorescence in Fluorescence Microscopy"	The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 2002, Vol.: 50 issue: 3, page(s): 437-439
"Reduction of Lipofuscin-like Autofluorescence in Fluorescently Labeled Tissue"	The Journal of Histochemistry & Cytochemistry 1999, Vol. 47(6): 719–730

Fijación

Paraformaldehido 4% (PFA 4%)

Es un buen método de fijación para las inmunofluorescencias. La integridad estructural de la célula no queda tan bien como con el glutaraldehido pero los sitios antigénicos generalmente no se ven muy afectados y además genera muy poca autofluorescencia.

Preparación:
1. Disolver paraformaldehido al 4% (= 10% formalina) en agua destilada precalentada a 55-60ºC
2. Añadir unas gotas de NaOH 1M y agitar hasta disolver totalmente
3. Enfriar hasta temperatura ambiente (RT). Añadir PBS hasta 1X y llevar el pH a 7.4
4. Utilizar esta solución fresca no más de 1 semana a RT (se puede congelar en alícuotas a -20ºC por varios meses)

Uso:
1. Lavar los cubres con PBS y fijar 15' con PFA 4% añadiéndolo lentamente
2. Lavar los cubres con PBS (3x5')
3. Guardar los cubres fijados a 4ºC en PBS con 0.01 % Azida o comenzar la inmunofluorescencia

Formaldehido- Acetona

Uso:
1. Lavar los cubres con PBS a 37ºC
2. Fijar las células con PFA 4% en PBS durante 10' a RT
3. Lavar las células con PBS (3x5')
4. Permeabilizar las células con acetona a -20ºC durante 10'. Desarrollar la incubación a -20ºC
5. 5. A continuación: a) Secar los cubres y guardarlos a 4ºC o b) rehidratarlos con PBS durante 10' a RT y comenzar la inmunofluorescencia

Formalina (Formalin solution, Sigma- HT501128)

Uso:
1. Lavar los cubres con PBS y fijar durante 20' con formalina añadiéndolo lentamente
2. Lavar los cubres con PBS (3x5')
3. Guardar los cubres fijados a 4ºC en PBS con 0.01 % Azida o comenzar la inmunofluorescencia

Metanol

Es un buen método de fijación si queremos mantener la integridad estructural de la célula, aunque los sitios antigénicos de unión al anticuerpo pueden verse dañados. Además, para una permeabilización efectiva puede ser necesario el uso de un detergente aniónico.

Uso:
1. Lavar los cubres con PBS.
2. Añadir Metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'
3. Retirar el Metanol, rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluorescencia directamente con la incubación del anticuerpo primario

Acetona

Con esta fijación se preservan muy bien los sitios antigénicos de unión al anticuerpo y la cantidad de fluorescencia de fondo que se genera es muy baja. Sin embargo, la integridad estructural de la célula desaparece, aunque cuando son visualizadas en widefield la estructura permanece suficientemente intacta como para analizar la localización subcelular de la proteína de interés. Sin embargo, cuando se intenta hacer un estudio en 3D mediante microscopía confocal se aprecia que las células fijadas mediante acetona han perdido su tridimensionalidad. La estructura celular, al contrario que la fijación por metanol, no es visible a través de luz transmitida. La acetona es un buen agente permeabilizador por lo que el tratamiento posterior con detergente no es necesario.

Uso:
1. Lavar los cubres con PBS
2. Añadir Metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 10'
3. Lavar las células con PBS (3x5')

Acetona-Metanol

Un buen compromiso entre la naturaleza destructiva de la acetona y la falta de marcaje procedente del metanol es usar la combinación acetona-metanol. A menudo, suele ser una buena idea empezar con una relación 50:50 aunque hay que buscar la mejor relación (en algunos casos esta es acetona: metanol 20:80)

Uso:
1. Lavar los cubres con PBS
2. Añadir acetona:metanol a -20ºC muy lentamente sobre las células e incubar a -20ºC durante 15'
3. Retirar la mezcla y rehidratar lavando con PBS (2x5') y comenzar la inmunofluorescencia a partir de la incubación con el anticuerpo primario

Glutaraldehido

Es el método estándar de fijación para microscopía electrónica. Preserva muy bien la estructura, pero desafortunadamente la mayor parte de los sitios de unión al anticuerpo los destruye generando, además, en las células fijadas mucha autofluorescencia. Incubando las células fijadas con una solución de Borhidruro de Sodio durante varios minutos puede disminuir la cantidad de autofluorescencia que se genera en la fijación. Una buena solución puede ser emplear una combinación de glutaraldehido 0.25% con paraformaldehido.

Inmunofluorescencia

ANTES DE NADA SE DEBERÍAN REALIZAR TRES TIPOS DE CONTROLES:

AUTOFLUORESCENCIA:

Desarrollando el mismo protocolo pero sin anticuerpos primario y secundario.
ANTICUERPOS SECUNDARIOS:

Incubando la muestra sólo con cada uno de los anticuerpos secundarios.
CRUCE O INTERFERENCIA DE CANALES:

Incubando con cada una de las combinaciones de anticuerpo primario y secundario por separado.
Para comprobar el cruce de canales en estas muestras se usarán las condiciones de la muestra problema (con todos los canales).

INCUBACIÓN SIMULTÁNEA FRENTE A LA SECUENCIAL:
Aunque la incubación simultánea en un mismo paso con los anticuerpos primarios por un lado y los secundarios por otro es más rápida y cómoda, es preferible incubar secuencialmente, primero con uno de los primarios y después con su secundario correspondiente. Así sucesivamente con todos los demás..

Cultivos celulares

Si es necesario, eliminar la autofluorescencia.
Tratar los cubres durante 10' con PBS/0.1% Tritón X-100 a temperatura ambiente (RT).
Incubarlos a RT durante 10' con la solución de bloqueo (1-5 % BSA o 1-5 % suero fetal de ternera en PBS/0.1% Tritón X-100, o MAXblock™ Blocking Medium (Active Motif)).
Incubar las células durante 1h a RT con el anticuerpo primario diluido en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 5' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC para eliminar agregados y reducir fondo.
Sumergir los cubres unas 3 veces en PBS para lavarlos.
Incubar las células durante 45' en oscuridad a RT con el anticuerpo secundario diluido en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC. En el caso de usar faloidinas mejor incubar en PBS sin más.
Sumergir los cubres unas 3 veces en PBS para lavarlos.
Sumergir los cubres una vez en agua destilada y secar el exceso sobre papel.
Pasar los cubres brevemente por EtOH y secar el exceso sobre papel. Este paso no es estrictamente necesario
Inmediatamente después montarlos sobre los portas.
MONTAJE:
- Depositar con la punta de un tip amarillo una gota de un medio de montaje sobre el porta.
- A continuación colocar suavemente el cubre con las células boca-abajo sobre la gota de medio y presionar ligeramente con papel de filtro para que quede exclusivamente una fina capa de medio entre el porta y el cubre. En caso de preparaciones de gran grosor cuidado con esto último porque podéis alterar el volumen real de la muestra.
- Dejar secar durante 24 horas a RT en oscuridad sobre papel de filtro. Puede secarse en estufa a 37ºC durante 3 ó 4 horas, pero mejor a RT.
- Sellar los bordes con laca de uñas. Esto sólo si se van a guardar las preparaciones durante mucho tiempo.
- Guardados a 4ºC en oscuridad pueden durar muchos meses. No guardar nunca la preparación a 4ºC antes de que esté realmente seca.

Tejidos

Protocolo general

NOTA: A ser posible desarrollar estos pasos con los cortes flotantes y en agitador giratorio.

Utilizar algún método para eliminar la autofluorescencia.
Incubar con la solución de permeabilización (0.1% Tritón X-100 en PBS) durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
Incubar con solución de bloqueo (1% suero en PBS/0.1% Tritón X-100) durante 1-2 horas a RT.
Incubar con el anticuerpo primario durante toda la noche a 4ºC diluido en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC. Para secciones de más de 50 micras es posible prolongar la incubación durante dos noches haciéndolo a RT. En tal caso, añadir 0.02% de Azida sódica.
Lavar 5 veces durante 5 minutos con PBS.
Incubar con el anticuerpo secundario durante 12-18 horas a RT en oscuridad, diluido en la solución de bloqueo. Centrifugarlo previamente durante 10' a 12.000xg en la minifuga a 4ºC.
Lavar con la solución de permeabilización durante 1 hora con cambios frecuentes.
Lavar con PBS durante otra hora con cambios frecuentes. Los cortes se pueden guardar en PBS o Paraformaldehido 4% durante varios días. Es preferible no pasar al paso siguiente hasta que no se vayan a observar.
Poner las secciones en portas y añadir medio de montaje. Colocar un cubre encima.

Protocolo general con DAB

Protocolo específico para tejido nervioso

Protocolo elaborado a partir de “Unraveling human adult hippocampal neurogenesis”. Nat Protoc 15, 668–693 (2020).

NOTA: Condiciones aptas para una serie de anticuerpos primarios y para secciones de cerebro humano de 50 µm. Es conveniente probar diferentes tiempos de incubación para poner a punto los anticuerpos de interés.

Fijación: inmediatamente después de extraer y diseccionar el tejido, sumergirlo en 4% PFA durante 24h a 4ºC. Lavar 30s x 3 en 0,1N PB a temperatura ambiente.
Embeber el tejido en agarosa:
- Preparar una solución de 10% sacarosa + 4% agarosa low melting, calentada al microondas para hacerla líquida y llenar el pocillo de una placa M6-M12.
- Poner la placa en hielo y sumergir el tejido. Es posible que flote durante los 2 primeros minutos. Empujarlo hacia el fondo para evitarlo. Esperar a que la agarosa solidifique completamente.
- Cortar un cubo que contenga el tejido, que tenga 2-3 mm de agarosa extra en todas las dimensiones.
Seccionar: cortar en el vibratomo secciones de 50 µm recolectando los cortes en 0,1 N PB.
Incubar las secciones con 0,5% NaBH4 / 0.1N PB durante 30 min (este paso no es necesario si el tejido es de ratón). Poner la placa a RT en un agitador orbital con agitación suave. La aparición de burbujas es frecuente.
Lavar 30s x 5 veces con PBT-BSA.
HC-AR (antigen retrieval con citrato), en caso necesario:
- Rellenar viales de cristal de 10ml con 5ml de 1x Citrato Buffer (pH 6.0) precalentado a 90ºC (hacer el buffer antes de su uso).
- Colocar de una a cuatro secciones que pertenezcan al mismo tipo de muestra en cada vial de cristal y cerrar sin sellarlo para evitar un aumento de presión durante el calentamiento al microondas.
- Exponer los viales entre 5-6 ciclos (10-20s) de microondas (de 800w a máxima potencia). Para evitar dañar el tejido nunca debe hervir el líquido (si el líquido hirviese se deberían suspender los ciclos de microondas). Entre un ciclo y el siguiente hay que esperar unos segundos. El procedimiento del microondas debe repetirse hasta que los bordes de las secciones empiecen a curvarse ligeramente (cuando esto ocurra hay que parar). Evitar el excesivo plegamiento de los bordes de las secciones para prevenir el daño de la muestra, la aparición de fondo y para conservar la especificidad de la señal.
- Cerrar bien los viales y sumergirlos en un baño de agua a 80 ºC durante 20 min.
- Dejar los viales cerrados a RT durante 20min.
- Sacar las secciones de los viales con ayuda de un pincel suave y lavarlos 30s x 5 en 0.1 N PB.
Incubación con el anticuerpo primario: poner en cada pocillo de una placa M24 el anticuerpo primario diluido en PBT-BSA. Meter las secciones y asegurarnos de que están flotando (350-400 µl por pocillo en este tipo de placas es adecuado para incubar hasta dos secciones). Incubar durante 5 días a 4º C con agitación suave (ajustar experimentalmente las condiciones y el tiempo de incubación al anticuerpo empleado).
Lavar las secciones 30s x 5 con PBT-BSA.
Incubación con el anticuerpo secundario: poner en cada pocillo de una placa M24 el anticuerpo secundario diluido en PBT-BSA. Incubar en oscuridad a 4ºC ON con agitación suave (500 µl por pocillo es adecuado para un máximo de tres secciones). A partir de este paso las secciones deben mantenerse en oscuridad. Para ello, puede emplearse papel de aluminio.
Lavar las secciones 30s x3 con 0.1N PB.
Incubación con Dapi (opcional): para hacer la tinción de núcleos se pueden teñir las secciones flotantes con Dapi (1:5000 v/v en 0.1 N PB) durante 10 min a RT con agitación suave. Para un máximo de tres secciones por pocillo de una M24 se puede usar un volumen de 500 µl.
Lavar las secciones 30s x 3 con 0.1 N PB a RT.
Eliminación de autofluorescencia:
- Sumergir las secciones en 1ml de 70% de etanol durante 5min con agitación suave. 500 µl serían suficientes para un máximo de tres secciones por pocillo.
- Incubar las secciones en el reactivo comercial Autofluorescence Eliminator (Sudan Black diluido en etanol) durante 5 min con agitación abundante para prevenir la precipitación del reactivo. 200-300 µl debe ser suficiente (hay que tener en cuenta que las secciones se quedarán teñidas de negro). Este tratamiento debería ajustarse en función de la autofluorescencia nativa del tejido.
- Lavar las secciones 1min x 3 con 1ml de 70% etanol con agitación fuerte. Hay que asegurarnos de que los precipitados del Eliminator son eliminados con estos lavados.
Lavar las secciones 30s x 3 en 1ml de 0.1 N PB a RT con agitación suave.
Montar las secciones: poner las secciones en un portaobjetos tratado con 2% de gelatina. El uso de un medio de montaje comercial o no es optativo. Una vez añadido el medio de montaje poner un cubreobjetos y dejar que la preparación se seque protegiéndolo de la luz. Con mucho cuidado hay que limpiar el exceso de medio de montaje.
Las muestras pueden almacenarse a RT en oscuridad. Es recomendable que las imágenes se adquieran dentro del mes siguiente al montaje.

Protocolo gónadas Drosphila adulta

Enlaces

Medios de montaje

Es conveniente testar varios medios de montaje ya que puede ocurrir que disminuyan o incluso desaparezca la señal de algún canal simplemente por utilizar un medio incompatible con el marcaje que estamos realizando.
Para análisis 3D el medio de montaje empleado no debe endurecer.

Mowiol/Dabco

Mezclar 6 g. de glicerol con 2.4 g. de Mowiol (Calbiochem Ref.475904, Polysciences Ref.17951) en un tubo de centrifuga de 50 ml con una barra agitadora.
Mientras se mezclan ir añadiendo 6 ml de agua MiliQ y dejar 2h a temperatura ambiente (RT).
Añadir12 ml de Tris 0.2M , pH 8.5 y 230 μl de Thimerosal 1% (p/v en agua) (agente antibacteriano y antifúngico).
Incubar en un baño a 50ºC durante 10' con agitación frecuente para disolver bien el Mowiol. Esta operación conviene repetirla hasta que el Mowiol quede bien disuelto.
Añadir 2.5% DABCO (1,4-diazobicyclo-(2,2,2)-octane).
Centrifugar a 5000xg durante 15' para eliminar finos. Almacenar en alícuotas de 1 ml a –20ºC. Es estable durante un año. Después de usarlo guardar a 4ºC (puede durar así hasta un mes). Descartarlo cuando empiecen a aparecer depósitos cristalinos en las preparaciones.

Propyl Gallate

Phenylenediamine

PVA-Dabco

Medio de Murray

Productos comerciales

Tratamiento de cubres y adhesión

Estudios in vivo

Técnicas de microscopía

Tratamiento de imagen

Tarifas

Tarifas 2021

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Si endurecen	ProLong Glass, Diamond, Gold. (ThermoFisher Scientific)
Si endurecen	Vectashied Vibrance (Vector Laboratories).
No endurecen	Vectashield (Vector Laboratories)
	Fluoromount G (ThermoFisher Scientific)
	Glicerol (varias casas comerciales). Se usa a varios porcentajes 50% (DIC), 75% (DIC+IFI), 90% (IFI)

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